植物基因工程实验技术

植物基因工程实验技术编者:赵燕主审:张学文湖南农业大学植物科学实验教学中心2007年4月1前言基因工程是现代生物技术的核心，也是现代分子生物学研究的重要手段。掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业学生都很重要。基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技术体系，本实验指导侧重于DNA重组操作，将基因工程操作的常用和核心技术组织起来，以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基因工程实验提供简单而明确的指导。为适应基因工程的飞速发展，一些生物技术公司匠心独运，开发出专门的试剂盒，使一些复杂的实验操作简单化了。这对于实验者来说自然是好事，但也使实验者动手胜于用脑。对于实验人员来说，一定应知其然并知其所以然，才会在实验中运用自己的知识予以创新性的发展。期望本实验指导不成为实验中的教条。编者2007年4月2目录实验一大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存...............3实验二强碱法小量制备质粒DNA.....................................................5实验三琼脂糖凝胶电泳......................................................................7实验四植物总DNA的提取、纯化和检测........................................9实验五DNA的PCR扩增.................................................................11实验六植物总RNA的分离.............................................................15实验七RT-PCR..................................................................................17实验八体外重组分子的构建、筛选及检测.....................................21实验九植物表达载体的构建、筛选及检测.....................................22实验十植物遗传转化技术................................................................23附录:实验中常用的仪器与器皿.....................................................243实验一大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存大肠杆菌(Escherichiacoli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。一.实验目的:掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。二.实验原理:大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA，这是一种双链闭合环状的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常质粒DNA带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:1．对抗生素的抗性2．产生抗生素3．降解有机复合物4．产生大肠杆菌素5．产生内毒素6．产生限制修饰酶pUC19质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。三．实验材料:E．coliInvaF'E．coliInvaF'(pUC19)四．实验仪器、器皿及试剂:仪器:超净工作台恒温培养箱高压灭菌锅恒温水浴锅微波炉等器皿:(见附录)试剂:琼脂酵母抽提物胰蛋白胨Nacl氨苄青霉素NaOH等五．实验步骤:1.配制培养基：ａ．LB(Lurib-Bertani)media酵母抽提物(Yeastextract)5g/L胰蛋白胨(trytone)10g/LNacl10g/L4加蒸馏水定容至1000ml调节pH值至7.0。配制750ml固体培养基:在上述液体培养基中，按15g/L加入琼脂加热至充分熔化，即成固体培养基。ｂ：50%的丙三醇:取50ml丙三醇加入50mlddH2O至100ml。将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min2.倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入Amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。3.待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:E.coliInvaF'和E.coliInvaF'(pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:第一次划线后接种环灼烧第二次划线起点与第一次如此在平板上再进行第二次划线划线交叉，接种环灼烧后再划线5-6次进行第三次划线4.接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。5.比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coliInvaF'E.coliInvaF'(pUC19)的单菌落分别接种至含Amp和不含Amp的5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。6.分别吸取0．5ml菌液在无菌条件下，加入0．5ml50%丙三醇，置一灭菌的冻干管中，混匀至-20℃保存。思考题:1.平板培养细菌为什么要倒置培养?2.细菌的继代繁殖为何要强调单菌落分离?3.在固体培养基中怎样加入抗生素?4.简述单菌落分离的接种过程。5实验二强碱法小量制备质粒DNA一．实验目的:了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。二．实验原理:碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体DNA，质粒DNA及其它物质，通过一系列的纯化过程:高盐除核DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出质粒DNA和RNA等，RNA再经RNase消化，得到质粒DNA，这种质粒DNA可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。三.实验材料:EcoliInvaF'(pUC19)四.实验仪器、器皿及试剂:仪器、器皿(见附录)试剂:1．溶液1(GTE)50mmol/l葡萄糖10mmol/lEDTA-Na225mmol/lTris-Cl(pH8.0)4mg/ml溶菌酶2．溶液2200mmol/lNaOH1%SDS3．溶液35mol/lKAC60ml冰乙酸11．5mlddH2O28．5ml4．苯酚-氯仿5.异丙醇(或95%乙醇，100%乙醇)6.70%乙醇7.TE(pH8.0):10mmol/lTris-Cl(pH8.0)1mmol/lEDTA-Na28．RNase1mg/mlAmp100ug/ml6五.实验步骤:1.挑取一单菌落的EcoliInvaF'(pUC19)菌种接种到含Amp100ug/ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。2.吸1．4ml菌液至eppendorf管中，在高速台式离心机上5，000g离心2min，倒去培养基。3.重复1次，尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。4.将细菌悬于500ul冰冷的溶液1中，于离心机上5，000g离心2min。5.倒去溶液1，再悬于200ul冰冷的溶液1中。6.加入300ul新配制的溶液2，冰浴5min。7.加入300ul冰冷的溶液3，中和，轻轻振荡10sec，至冰浴5min。8.于离心机上，10，000g离心5min。9.取上清转移至一新管中，并加入RNase酶至50ug/ml，于37℃水浴中温浴30min。10.加入等体积的饱和酚抽提1次，10，000g离心5min取上清液。11.再加入等体积的氯仿抽提1次，10，000g离心5min取上清液。12.加入750ul异丙醇，沉淀质粒DNA，10，000g离心10min。13.倒去异丙醇，用70%乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5min。14.置冰箱内开盖干燥，悬浮至40ul去离子水或TE中。思考题:1.有机溶剂抽提为什么可以达到除蛋白，脂类杂质的目的?2.异丙醇沉淀DNA后为什么要经过70%乙醇清洗这一步?3.逐步说明强碱法提取质粒DNA的原理。7实验三琼脂糖凝胶电泳一．实验目的:学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳技术，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。二．实验原理:琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，它具有亲水性且不含带电荷的基团，是一种很好的电泳支持物，DNA分子在碱性环境中带负电荷，在电场作用下向正极泳动，不同的DNA片段由于电荷、分子大小及构型不同，在电场中所受的动力及琼脂糖交联分子的阻力不同，小分子及构型紧密的分子泳动较快，大分子则较慢，大小相同的分子形成一条带，于是达到了分离DNA分子的目的。三．实验材料:菌种Ecoli．INVαF，(pUC19)四．实验仪器、器皿及试剂:仪器、器皿(见附录)试剂:1．电泳缓冲液:5×TBEpH8．0(使用浓度为0．5×)配制:称取54．0gTris，27．5g硼酸，加入20ml500mmol/l的EDTA，先加800ml重蒸水，加热溶解后，再加重蒸水定容至1000ml。2．1mg/ml溴化乙锭溶液(EB)配制:带手套谨慎称取1mg溴化乙锭，溶于1ml重蒸水中，置4℃冰箱备用。(EB是DNA的诱变剂，亦是强致癌屋，操作时应小心!)3．琼脂糖:视实验要求制不同浓度的胶，用0．5×TBE作溶剂配制。4．0．2%溴酚蓝，50%蔗糖指示剂(Loadingbuffer)配制:称取溴酚蓝100mg，加重蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称蔗糖25g，加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至50ml，加NaOH1-2滴调至蓝色。五．实验步骤:81.琼脂糖凝胶的制备:琼脂糖凝胶的浓度一般为0．5%-1．5%，称取1g琼脂糖于250ml的三角瓶中，加入100ml0．5×TBE于微波炉内充分加热煮沸，慢慢冷却至50℃以下，电泳平板洗净后晾干，两端封上胶布，置于水平板上，架上梳子后倒入凝胶液4-5mm厚，待凝胶充分凝固后，撕下两端胶布，置于电泳槽内，加入电泳缓冲液至浸没胶0．5mm左右，轻轻拔出梳子，接上电源，明确电源极性。2.样品准备:电泳样品DNA的量由电泳所跑的带的数量而定，一般为2-800ng，质粒DNA一般为两条带，这是由同种分子构型差异而形成的，点样量为300ng左右。吸取质粒DNApUC1912ulTE或重蒸水4ulLoadingbuffer4ul3.点样4.开稳压电源，电压调整至1-5V/cm，电泳3-4小时。5.染色:电泳后的凝胶，置于含溴化乙锭0．5ug/ml(EB)的蒸馏水或TBE染色0．5h，为方便起见，常在电泳时在电泳液中加EB或直接在凝胶中加入EB。6.观察电泳结果:将凝胶置于透射式紫外检测仪上，在紫外灯下可见荧光带。7.绘出电泳带草图。思考题:1.简述DNA分子大下电泳确定法。2.凝胶电泳为什么能分离不同构型或分子大小DNA?3.你认为迁移率与分子大小是否成直线关系。9实验四植物总DNA的提取、纯化和检测植物DNA是进行分子遗传研究的基本对象，提取完整，高纯度的DNA是研究中很重要的一环，在近年来兴起的分子育种中运用尤为广泛，掌握植物DNA的提取方法，了解其原理有其重要意义，本实验在着重于原理的前提下，介绍一种可适用于多种植物的简便方法。一．实验目的:学习植物总DNA的提取、纯化及检测方法二．实验原理:植物DNA的提取首先是机械破碎植物细胞，可采用石英砂或氧化铝研磨法，液氮冷冻研磨法等，在研磨液中含有SDS破细胞膜，蛋白酶水解除DNA结合蛋白，再以有机溶剂除去蛋白、脂类