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生物化学实用技术主讲老师：刘名江生物与生态工程学院（一）生物大分子的制备和保存技术——蛋白质、核酸的分离和提纯研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。生物大分子的制备一般分为以下四个阶段：①选择材料和预处理；②细胞的破碎及细胞器的分离；③提取和纯化；④浓缩干燥和保存(冷冻干燥)。（二）色谱分离技术色谱分离技术，又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用混合物中各组分的理化性质（溶解度、吸附力、分子极性、分子形状和大小等）的不同，使各组分以不同程度在两个相中，其中一个相是固定的。不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离色谱分析法的由来1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。工业色谱分离技术原理色谱分离技术是基于不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，在采用流动相洗脱过程中呈现不同保留时间，从而实现分离。传统色谱分离技术采用固定的色谱塔进行，先进入一定量物料，然后采用洗脱剂不断洗脱，在同一出口在不同时间段就可接到不同的产品组分，此过程费时费力。经过分析并加以改进，我们把固定相的树脂做成可以连续流动的系统，利用物质与固定相的相对运动速度不同实现分离。类似龟兔赛跑的原理，我们把固定相必成一个传送带，把兔子乌龟分别必成快慢不同的两组份，只要使固定相加上一个与洗脱方向相反的驱动力，使传送带运动速度处于兔子和乌龟速度中间，跑的快的兔子比固定相快从前头得到，跑得慢的乌龟被传送带带到后面得到。凝胶色谱分离技术原理2、色谱法的特点（1）分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。（2）检测能力强：可以检测出10-11~10-15克级的痕量组分，能满足环境检测、农药残留等大量日常检测分析的需要。（3）样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。（4）适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之地。3、色谱分类气固色谱气相色谱气液色谱液固色谱液相色谱液液色谱超临界流体色谱毛细管电泳流动相与固定相聚集态（1）按两相所处的物态分类（2）按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。（3）按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。（4）按照展开程序分类按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图AB这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图AB此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。分类按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱按固定相在支持体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱液-固色谱1、概念分光光度法（AbsorptionPhotometry）是一种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。是利用物质所特有的吸收光谱对物质进行定性或定量分析的一项技术。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。（二）分光光度技术2、特点吸光光度法同滴定分析法、重量分析法相比，有以下一些特点：(1)灵敏度高吸光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达1-10-3%的微量组分。对固体试样一般可测到10-4%。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。(2)准确度较高一般吸光光度法的相对误差为2-5%，其准确度虽不如滴定分析法及重量法，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至无法进行测定。(3)操作简便，测定速度快(4)应用广泛几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。3、光的本质与溶液颜色的关系（1）光的基本性质光是电磁波。通常用波长、频率来描述。（2）物质的颜色与吸收光的关系从光本身来说、有些波长的光线，作用于眼睛引起了颜色的感觉，我们把人眼所能看见有颜色的光叫做可见光，其波长范围大约在400-760nm之间。实验证明：白光(日光、白炽电灯光、日光灯光等)是由各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。如果让一束白光通过三棱镜，就分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。每种颜色的光具有一定的波长范围。我们把白光叫做复合光；把只具有一种颜色的光，叫做单色光。实验还证明，不仅七种单色光可以混合成白光，如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混合，也可以成为白光。这两种单色光就叫做互补色。如绿光和紫光互补，蓝光和黄光互补，等等。对固体物质来说，当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性的吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的光透过程度相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。其实，任何一种溶液．对不同波长的光的吸收程度是不相等的。如果将某种波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光谱曲线或光吸收曲线。它清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。4、光的吸收定律（1）透光率和吸光度当一束单色光透过均匀、无散射的溶液时，一部分被吸收，一部分透过溶液，即I0＝Ia＋It式中：I0为入射光的强度，Ia为溶液吸收光的强度，It为透过光强度。透光率，用符号T表示，即：T＝It/I0×100%透光度率的倒数反映了物质对光的吸收程度，应用时取它的对数做为吸光度，用A表示。即：A＝lgI0/It＝lg1/T＝－lgT0IIt0IIt0IIt（2）光的吸收定律：朗伯－比尔定律当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。A＝KcL朗伯－比尔定律不仅适用于有色溶液，也适用于无色溶液及气体和固体的非散射均匀体系；不仅适用于可见光区的单色光，也适用于紫外和红外光区的单色光。（3）吸光系数摩尔吸光系数指波长一定时，溶液的浓度为1mol/L时，液层厚度为1cm的吸光度，单位为L/(mol·cm)，用ε表示。ε＝A/cL比吸光系数指波长一定时，溶液浓度为g/L，液层厚度为1cm的吸光度，单位为L/(g·cm)，用表示。α＝A/cL可以通过下式换算：ε＝αMM为摩尔质量5、吸收光谱吸收光谱又称吸收光谱曲线，它是在浓度一定的条件下，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，所绘制的曲线。曲线上吸光度最大的地方称为最大吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用表示。KMnO4吸收光谱曲线6、定量分析方法（1）单组分的定量A、标准曲线法测定时，先取与被测物质含有相同组分的标准品，配成一系列浓度不同的标准溶液，置于相同厚度的吸收池中，分别测其吸光度。然后以溶液浓度c为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制A－c曲线图，如果符合比尔定律，该曲线为通过原点的一条直线-标准曲线，如右图所示。在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上便可查出与此吸光度对应的样品溶液的浓度。标准曲线（A-c曲线）B、对照法对照法又称比较法。在相同条件下在线性范围内配制样品溶液和标准溶液，在选定波长处，分别测量吸光度。根据比尔定律A样＝K样·c样·L样A标＝K标·c标·L标因是同种物质，同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长测定，故K样＝K标，L样＝L标，所以：c样＝A样/A标·c标为了减少误差，比较法配制的标准溶液浓度常与样品溶液的浓度相接近。当测定不纯样品中某纯品的含量时，可先配制相同浓度的不纯样品溶液（c原样）和标准品溶液，即c原样＝c标，c样为c原样溶液中纯被测物的浓度。在最大吸收峰处分别测定其吸光度A值，便可直接计算出样品的含量。标样原样标样标原样样纯被测组分AAcAAccc（2）多组分的定量根据吸光度的加和性，可以在同一试样中不经分离同时测定两个以上的组分上图（a）表明，A、B组分互不干扰，因此可分别在处测定A、B组分的吸光度，从而求出各自的含量。上图（b）则说明溶液中A、B组分彼此相互干扰，这时可在波长处分别测定A、B两组分的总的吸光度A1和A2，然后再根据吸光度的加和性联立方程BBAAbcbcA111BBAAbcbcA2227、吸光度的测量原理分光光度计实际上测得的是光电流或电压，通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度A。测定时，只要将待测物