植物次生代谢基因工程研究进展

11杨致荣等:植物次生代谢基因工程研究进展1期2004-03-19收到，2004-10-10接受。国家教育部归国留学人员科研基金(No.2001-11)和科技重点项目(No.2002-03)资助。*通讯作者(E-mail:[e-mail];Tel:[phone])。植物次生代谢基因工程研究进展杨致荣，毛雪，李润植*(山西农业大学生物工程中心，太谷030801)摘要：随着对植物代谢网络日渐全面的认识，应用基因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良已取得了可喜的进展。对次生代谢途径进行基因修饰的策略包括：导入单个、多个靶基因或一个完整的代谢途径，使宿主植物合成新的目标物质；通过反义RNA和RNA干涉等技术降低靶基因的表达水平，从而抑制竞争性代谢途径，改变代谢流和增加目标物质的含量；对控制多个生物合成基因的转录因子进行修饰，更有效地调控植物次生代谢以提高特定化合物的积累。作者结合对大豆种子异黄酮类代谢调控和基因工程改良的研究，着重介绍了花青素和黄酮类物质、生物碱、萜类化合物和安息香酸衍生物等次生代谢产物生物合成的基因工程研究进展。关键词：次生代谢；基因工程；限速酶；转录因子中图分类号：Q74植物次生代谢及其产物在植物与环境互作和整个生命活动中行使着重要的功能：它们可构成植物防御体系的一部分(如植物他感素、单宁和棉酚等抗病虫化合物)，参与植物的逆境胁迫反应(如甜菜碱、甘露醇和海藻糖等)。我们对棉花抗蚜虫机制的研究结果表明，次生代谢物(棉酚、单宁和黄酮类等)及其相关酶基因的时空表达和积累所造成的生化异质性是植物防御虫害的主要机制之一(李润植等1998a,b；毛雪等1999)。一些次生代谢物(如花青素等)使花瓣产生各种色泽、吸引昆虫传粉，有利于植物繁殖。生长素等次生代谢物可调节植物的生长发育。此外，许多植物次生代谢产物还具有重要经济价值。例如，一些次生代谢物决定着植物源食品的口感、颜色、气味和营养价值(如类胡萝卜素)等。25%的临床药物都是直接或间接地取自植物的次生代谢产物。植物次生代谢物还可用于生产染料、杀虫剂、食品的调味剂及香料等。因此，对植物次生代谢进行遗传改良，以培育能够大量合成和积累目标次生代谢物的植物品种，受到愈来愈多的关注。应用常规育种方法改良植物次生代谢已有成功的经验，富含芥子油苷(glucosinolate)的花椰菜品种的育成就是一例。芥子油苷被认为有预防癌症的功效，它是作为抗癌变的标识酶即苯醌还原酶的诱导物来起作用的。新育成的杂交种在诱导此酶的能力上提高了100倍(Harborne2001)。然而，植物次生代谢物种类繁多，生物合成途径也千差万别，应用常规技术改良植物次生代谢的遗传特性进展缓慢。随着对植物次生代谢网络的研究和认识的深入，以及分子克隆和遗传转化技术的飞速发展，应用基因工程对植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，即植物次生代谢基因工程的研究日益增多，已发展为具有广阔应用前景的热点研究领域。迄今，已建立的植物次生代谢途径基因修饰的策略主要有，导入单个、多个靶基因(例如编码目标途径限速酶的基因)或一个完整的代谢途径，使宿主植物合成新的目标物质；通过反义RNA和RNA干涉等技术减少靶基因的表达，从而抑制竞争性代谢途径，改变代谢流向和增加目标物质的含量；对控制多个生物合成基因的转录因子进行修饰，更有效地调控植物次生代谢以提高特定化合物的积累。目前，在基因水平上研究得最清楚的植物次生代谢途径是合成黄酮类及花青素的次生代谢途径(Forkmann和Martens2001)。在中间产物和酶水平上对其它次生代谢途径所进行的详细研究已经鉴定出许多具有重要医药价值的次生代谢物，如吲哚和异喹啉类生物碱等(Facchini2001)。结合我们对大豆种子异黄酮类代谢调控和基因工程改良的研究，本文着重论述了花青素和黄酮类物质、生物碱、萜类化合物和安息香酸衍综　述Review1231卷植物生理与分子生物学学报生物等次生代谢产物生物合成途径的基因工程研究进展。1　黄酮类生物合成途径的基因修饰1.1　生物合成基因黄酮类化合物是一种小分子酚类物质，广泛存在于植物界，具有多种生物功能，如：调节植物生长，保护植物免受紫外线的损伤，抗病虫等。花青素和黄酮类物质还具有较高的抗氧化活性，富含这两种物质的植物食品有利于人类健康和疾病预防。由于对这两条生物合成途径研究的较清楚，而且其生物合成途径的改变能很容易通过花色的改变来鉴定(Davies2000)。因此，自上世纪90年代早期，黄酮类和花青素的生物合成一直是植物次生代谢基因工程的一个主要目标(Capell和Christou2004)。Muir等(2001)发现查尔酮异构酶(chalconeisomerase，CHI)是黄酮类代谢途径中的早期酶，也是增加黄酮醇产物的关键酶。Verhoeyen等(2002)将矮牵牛CHI在番茄中超表达，导致转基因番茄果皮中黄酮类含量增加78倍、果肉中黄烷醇增加21倍。植株及果实的其它性状在转基因植株和对照之间没有区别。将查尔酮合成酶和黄酮醇合成酶基因导入番茄后，使这两个目标合成酶基因协同表达的转基因果肉中黄酮醇类物质积累显著增加。这些结果表明了应用基因工程技术使目标酶基因在番茄果实中超表达，增加番茄果实中有益于人体健康的化合物的生物合成量是可行的。豆类植物的异黄酮是一类植物抗毒素，在植株受微生物侵染后，这些抵抗微生物的活性化合物可被诱导合成。正常情况下，拟南芥、烟草和玉米等植物缺少合成这类化合物的能力。Jung等(2000)将一种细胞色素P450单加氧酶——异黄酮合成酶的基因导入这些植物，使该基因超表达，这些转基因植物均能合成异黄酮类物质。因此，苯丙烷类代谢途径的基因工程可进一步应用于提高异源植物中异黄酮的生物合成(杨致荣等2003)。1.2　转录因子植物代谢途径大多是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，对单个基因进行修饰有时难以奏效。研究发现一些转录因子可调控多个参与代谢途径基因的表达，例如，MYB类转录因子就参与了黄酮类物质的生物合成的调节(杨致荣等2004)。Broun(2004)通过转录因子的分子操作，调控植物代谢途径中目标代谢物合成的尝试已取得了成功。在玉米籽粒中，两种转录因子即R和C1通过共同作用调节着花青素生物合成。Grotewold等(1998)将转录因子R和C1在离体培养的未分化玉米细胞超表达，成功地诱导了完整的黄酮类合成途径。在水稻中，玉米转录因子R、C1和查尔酮合成酶基因的协同超表达也激活了花青素生物合成途径，增强了对真菌的抗性(Gandikota等2001)。Borevitz等(2000)应用T-DNA激活标签技术在拟南芥中鉴定出一种MYB类转录因子(productionofanthocyaninpigment1-Dominant,PAP1-D)，它的超表达能激活许多参与花青素生物合成途径的基因表达，使植物体中紫色素的含量明显增加。有些转录因子则是植物体内自然产物合成的抑制子。采用基因沉默技术关闭这类转录因子的表达，就能促使相关化合物的合成。例如，拟南芥转录因子AtMYB4，是参与芥子酸酯(sinapateesters)合成的关键酶——桂酸4-单加氧酶(C4H)的抑制子。Jin等(2000)将AtMYB4基因剔除，结果导致了C4H的大量表达，叶子中芥子酸酯增加，提高了抗紫外辐射的能力。Aharoni等(2001)克隆和鉴定了一个参与草莓果实黄酮类代谢途径的转录因子FaMYB1，该转录因子抑制黄酮类合成下游一些步骤。FaMYB1基因在烟草中的超表达引起了花青素和黄酮类化合物减少。相反，抑制或降低FaMYB1就会增加花青素和黄酮类化合物的积累。上述这些例子表明，通过一种或几种转录因子的超表达,可以改变植物生长发育过程中自然产物的合成和积累，甚至在异源植物种中也是可行的。我们课题组采用DNA微阵列技术，检测了大豆种子发育过程中各相关基因及序列的表达图谱，通过比较分析，初步确定了几类参与大豆异黄酮高积累代谢途径的候选基因和靶序列，包括一些催化关键反应的酶基因(如PAL，CHS，IFS)和转录因子(R/C1，TT2/TT8)。现正在用酵母表达系统对这些候选序列进行鉴定。同时，将目标合成酶基因超表达和沉默异黄酮类物质分解酶的策略相结合，构建了种子特异表达的IFS基因和抑制黄酮类3-羟化酶的表达盒，用基因枪法转化大豆幼13杨致荣等:植物次生代谢基因工程研究进展1期胚。测试结果表明转化的体细胞胚中异黄酮类物质比未转化的对照体细胞胚中高出3~5倍。这为进一步通过分子操作培育具有医药功能和独特营养价值的高含异黄酮大豆品种提供有益的信息(Li等2004)。2　生物碱生物合成途径的基因修饰2.1　吲哚生物碱现在已知，约15种萜类吲哚生物碱具有重要的医药和工业价值，例如，长春碱、长春新碱及喜树碱等具有抗肿瘤活性。因此，吲哚生物碱代谢途径就成为次生代谢途径基因工程研究的又一个重要靶标。与黄酮类和花青素生物合成途径的基因修饰策略相似，吲哚生物碱代谢途径的遗传改良可以通过对一些编码生物合成的基因和转录因子进行基因操作而实现。研究发现，许多吲哚生物碱共用一个可生成中间产物strictosidine(一种葡萄糖生物碱)的代谢途径，或者说不同植物生物碱的合成是从strictosidine处开始分支的。对控制这一代谢途径的上游步骤进行基因修饰，可使代谢物流通向目标吲哚生物碱的合成。Canel等(1998)应用长春花(Catharanthusroseus)细胞培养实验体系，对色氨酸脱羧酶(tryptophandecarboxylase,TDC)和strictosidine合成酶(STR)的基因进行操作，以期提高目标生物碱的合成。结果显示，编码TDC的基因超表达导致直接产物色胺增多，但是生物碱水平没有提高，而STR基因的超表达则使生物碱水平提高。若用含有色胺和萜类的介质培养这两种转基因细胞系，其细胞可合成大量的生物碱(高达1100µmol/L)(Whitmer1999)。由此可见，该代谢途径中的萜类分支是限速因素，也可能存在其它限速步骤。在其它不合成此类生物碱的植物中超表达编码TDC和STR的基因，同样也可以导致这些植物细胞合成此类生物碱(Facchini等2000)。对这些异源表达TDC和STR基因植物细胞中吲哚生物碱合成水平变化的分析还指出，pH等体内细胞生理状态以及控制转运的基因对目标产物合成和积累也有重要影响。Memelink等(2001)对C.roseus植物体内吲哚生物碱生物合成途径的详尽研究发现，受茉莉酮酸酯调控的转录因子即ORCA2和ORCA3，控制着该次生代谢途径中的几个步骤,但不影响催化开联番木鳖甙生物合成第一步的酶——香叶醇单加氧酶(geraniol10-hydroxylase，G10H)，尽管G10H也受茉莉酮酸酯调控。因而，在仅超表达ORCA3的转基因细胞系中生物碱含量并没有增加。如果在细胞培养介质中加入一定量的开联番木鳖甙的前体马钱苷(loganin)后，转ORCA3基因的细胞系生物碱合成比非转基因对照细胞系高3倍。他们的研究还显示，ORCA2和ORCA3也可调控其它代谢产物的合成，表明一些转录因子可用于调控代谢途径中一系列酶的活性。2.2　异喹啉生物碱黄连素、吗啡和可待因等异喹啉生物碱是重要的医用药物。对合成这类生物碱的次生代谢途径进行基因工程改良，经济价值更高。有关黄连素生物合成途径的研究发现，13种不同的酶参与从酪氨酸到黄连素合成过程。其中，S-金黄紫堇碱9-O-转甲基酶(S-scoulerine9-O-methyltransferase,SMT)是关键酶，它控制黄连(Coptisjaponica)细胞中的黄连碱(coptisine)与黄连素(berberine)和非洲防已碱(columbamine)的比率。Sato等(2001)在黄连细胞中超表达SMT基因，导致该酶活力增加20％，而且转基因细胞中黄连素和非洲防已碱从占原野生型细胞总生物碱的79％增加到91％。这表明通过对某一条代谢途径分支处的酶基因进