PCR引物设计

PCR引物设计Bioinformatics研究领域：基因克隆、测序、重组疾病诊断法医鉴定亲子鉴定古生物学研究PCR技术的应用PCR及其衍生技术兼并引物PCRRACE反向PCR（IP-CR）差异展示PCR(DD-PCR)多重PCRTD-PCRPCR-SSCPNet-PCRIC-PCRHotstartPCRSPARAPDRealtimePCRLD-PCRTall-PCRMarathonPCR原位PCRRT-PCR不对称PCROverlappingPCR……..PCR原理高温变性低温退火适温延伸理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。PCR引物是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。1、引物设计的原则①引物要跟模板紧密结合；②引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；③引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。引物设计需要考虑的因素引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)ΔG值(internalstability)引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）错误引发位点（falseprimingsite）引物及产物GC含量（composition）有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。引物设计要点（1）一般，引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp。PCR产物长度≤500bp引物长度16～18bpPCR产物长度≈5kb引物长度≈25bpPCR纪录：23bp长度引物扩增出40kb产物引物设计要点（2）引物3´端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3´端防止连续三个C或G引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物设计要点（3）引物的Tm值。过高（72℃）或过低（37℃）都不利于引发反应。上下游引物的Tm不能相差太大。(3)精确算法（邻近热力学）(4)TaOPT引物设计要点（4）ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。算法：邻近热力学例：ACGG和其互补TGCC结合的ΔG：ΔG(ACGG)=ΔG(AC)+ΔG(CG)+ΔG(GG)=-(1.3+3.6+3.1)=-8.0kcal/mol一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5´端和中间部分ΔG值较高，而3´端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。原理:引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合。因此，5´端与中间段的ΔG值应较高，而3´端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。引物设计要点（5）可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。错配（或称假引发）：将导致产生非专一产物引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。引物设计要点（6）1、发夹结构（Hairpin）自身互补2、二聚体（Dimer）两个引物间互补对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。引物设计要点（7）2、引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在2个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。一般认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。3、引物设计软件常用的引物设计软件PrimerPremier5Oligo6WONDERFUL生物信息学系统售价US$885US$885售价US$1200US$1200售价1700RMB1700RMBPrimerPremier5.0的使用技巧简介引物设计限制性内切酶位点分析motif查找同源性分析功能序列“朗读”DNA与蛋白序列的互换简并引物设计功能功能：简并引物：有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。简并度的计算：例如“,AlaAsnIleLysMet”的引物Ala=4,Asn=2,Ile=3,Lys=2,Met=14×2×3×2×1=48使用步骤及技巧PreimerPremier启动界面复制序列粘贴到此处进行引物设计时，点击按钮如果没有特殊要求，建议使用默认设置。引物长度引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围手动，自动5对引物每对产物的大小引物分值100分为满分该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成。点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。5´加入酶切位点设计简并引物PremierPrimer5PremierPrimer5提供了提供了88种生物遗传密码使种生物遗传密码使用的偏好选择用的偏好选择11、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（CiliateCiliateMacronuclearMacronuclear））22、无脊椎动物线粒体（、无脊椎动物线粒体（InvertebrateInvertebrateMitochondrionMitochondrion））33、支原体（、支原体（MycoplasmaMycoplasma））44、植物线粒体（、植物线粒体（PlantMitochondrionPlantMitochondrion））55、原生动物线粒体（、原生动物线粒体（ProtozoanProtozoanMitochondrionMitochondrion））66、一般标准（、一般标准（StandardStandard））77、脊椎动物线粒体（、脊椎动物线粒体（VertebrateVertebrateMitochondrionMitochondrion））88、酵母线粒体（、酵母线粒体（YeastMitochondrionYeastMitochondrion））注意事项(1)选择简并性低的氨基酸区域。(2)根据生物使用密码子的偏性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物的简并度。(3)引物的3´端不应存在简并。整体评价该软件是一款功能全面的引物设计软件，全面地给出了各种参数，并在多个必须的地方给出有效的评价。但是程序在设计中还有一些不足。–如：产物的Tm值和引物的Tm值之间的差异也未能给出评价，如果二者差异较大（22度），则容易造成退火时引物-模板和模板-模板火之间的竞争。–结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式Oligo6.71使用技巧简介功能在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。其初始界面有3个图：Tm图、ΔG图和Frq图（其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性）。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。使用Oligo6.71的启动界面如下：∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5´端和中间值比较高，而在3´端相对低。Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5´到3´的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq是邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。Frq曲线揭示了序列片段存在的重复机率大小。该频率高则增加错误引发的可能性。选取引物时，宜选用3´端Frq值相对较低的片段。在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。首先，检查引物二聚体尤其是3´端二聚体形成的可能性。第二项检查是发夹结构（hairpin）。一般来说，能值以不超过4.5为好。第三项检查为GC含量和Tm，以45-55％为宜，并且应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近。当我们结束以上检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。DNAClubDNAMAN