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1、实验室生物安全(Laboratorybiosafety):实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。2、生物安全防护基本要求实验室生物安全防护（biosafetyprotectionforlaboratories）实验对象：致病的微生物及其毒素综合措施：实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序和规程等确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。实验室生物安全通用原则积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物；主动封闭生物危害材料产生之源，防止从操作部位向周围环境释放；尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。3、实验室必须设有专职的生物安全负责人实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人。生物安全等级生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级。实验室生物安全防护要求：一级最低，四级最高。4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区和污染区5、各级生物防护实验室特点一级生物安全防护实验室（BSL-1/P1）：适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。二级生物安全防护实验室（BSL-2/P2）实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。在处理危险度2级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。三级生物安全防护实验室（BSL-3/P3）：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。四级生物安全防护实验室（BSL-4/P4）：适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。6、控制措施安全设备和个体防护是实验室工作人员与致病微生物及其毒素直接接触的一级屏障。所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶的操作，都必须在生物安全柜内进行。7、生物安全柜（BSC）biosafetycabinet(概念、分级及特点)具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜，可有效降低实验过程中产生的有害气溶胶对操作者和环境的危害。(净化排气)根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜可分为I、Ⅱ、Ⅲ级3种类型。实验室应按要求分别配备I、Ⅱ、Ⅲ级生物安全柜。Ⅰ级生物安全柜：外部空气保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。Ⅱ级生物安全柜：经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气既保证工作人员不受侵害，也保证实验对象不受污染；Ⅲ级生物安全柜：经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气8、生物安全柜和超净工作台的区别超净工作台：保护样品，不保护操作者和环境生物安全柜：保护操作者、环境以及实验材料正压、简单负压、复杂不能以净化工作台代替生物安全柜，反之则可以。9.标准的细菌等微生物操作要求实验室负责人......工作人员洗手、工作区域不允许吃/喝/抽......戴护目镜或面罩、食物储存禁止口吸吸管、减少飞溅物/气溶胶、工作台表面的去污/灭活、废物去污后处理10、注：高压蒸汽灭菌：负责消毒者不准离开消毒室。制备培养基.....无菌操作.、使用酒精灯、灭菌吸管......10倍递增稀释......无菌操作；三三制：稀释三级，每一稀释度用三个平行平板；取供试液加注于平皿时，供试液须充分混匀。培养基倾注于平皿：45℃±1℃、整个操作过程应在lh内完成、无菌检验......第二章、细菌学检验基本技术临床样本的采集与送检1、食品样本采集原则根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。随机采样→代表性无菌操作，防污染。（外源性污染、样本变质和细菌生长）食物中毒时，采集可疑食物样本。2、食品样本采集种类大样、中样、小样。样本采样时间采样方法注意事项血骨髓发病早期、急性期或症状典型时成人10ml，儿童3～5ml；骨髓1～2ml。样本切勿冰箱存放；无菌操作；废弃物高压灭菌。尿液晨起中段尿防杂菌污染，无菌操作。尽快送检，不得加防腐剂或消毒剂。粪便急性期脓血、黏液的粪便；絮状物；直肠拭子无菌采样；新鲜；立即送检。痰上呼吸道样本晨间无限制自然咳痰、支气管镜、胃内采痰法等；鼻咽拭子漱口；立即送检或4℃保存。大样：一整批样本。中样：从样本各部分所取得的混合样本，一般为200g。小样：分析用，检样，25g。注：检验结果报告后，剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检3、细菌的形态结构检查法借助显微镜，对细菌形态、大小、排列、结构进行直接观察。在细菌检验中极其重要，是细菌分类和鉴定不可缺少的组成部分。样本中有无细菌及其大致的数量。细菌的形态、大小、排列、结构和染色反应性。培养物是否为纯种。普通光学显微镜（0.2μm×1000＝0.2mm）细菌染色样本；弱光下用于不染色样本活菌的运动情况暗视野显微镜（0.04μm：50倍）不染色样本活菌的形态相差显微镜：活体细胞的外形和运动方式；细胞内部某些细微结构及这些结构的数量4、不染色检查：主要用于观察细菌的动力有鞭毛的细菌为真正运动无鞭毛的细菌则为布朗运动(即分子运动)染色检查细菌染色→显微镜观察。常用的细菌染料：人工合成带苯环的染料，色基+助色基单纯染料：苏丹染料酸性染料：伊红、酸性品红、刚果红等碱性染料：美蓝、孔雀绿、甲紫和碱性复红等复合染料：姬姆萨染料、瑞氏染料等5、单染色法：用一种染料染色，使各种细菌均染成同一颜色。操作简单，易于使用。只能显示细菌的形态及大小。如用美蓝或稀释石炭酸复红等6、复染色法：用两种以上染料染色细菌，显示细菌形态大小，鉴别细菌种类鉴别染色法:革兰染色法、抗酸染色法Grams染色操作步骤：初染、媒染、脱色、复染抗酸染色法：抗酸菌：分枝杆菌/分枝菌酸。一般不易着色，一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色。经过加热和延长染色时间来促使抗酸菌着色。步骤：初染、脱色、复染7、负染色法：背景着色而细菌本身不着色。细菌荚膜常用墨汁负染色法配合单染色法(如美蓝)，背景呈黑色，菌体染成蓝色，荚膜不着色，包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。该法具有快速、经济、简便易行、高度反差、分辨率高的特点。8、培养基的种类－－按物理性状分液体培养基：增菌、作生化试验等半固体培养基：观察细菌的动力、分类鉴定、保存菌种及噬菌体效价滴定等。琼脂用量为0.5%～1%固体培养基：主要用于分离培养；平板、斜面、高层及高层斜面；琼脂用量为1.5%～2%9、培养基的种类－－按用途分基础培养基(basicmedium)营养培养基(nutrientmedium)增菌培养基(enrichmentmedium)选择性培养基(selectivemedium)鉴别培养基(differentialmedium)专用培养基(dedicatedmedium)10、增菌培养基：多为液体。↑目的菌，↓杂菌。营养成分＋抑制物质选择性增菌培养基；非选择性增菌培养基7.5%NaCl肉汤：金葡増菌11、鉴别培养基：几种细菌由于对培养基中某一成分的分解能力不同，其菌落的生长特征(颜色、形状等)不同而被区分开。＋某些特定的化学物质鉴别和区分不同细菌12、制备培养基的一般程序○1调配溶化；○2矫正pH；○3过滤澄清；○4分装；○5灭菌；○6检定13、平板划线接种法平板划线接种法是常用的细菌分离培养方法。使样本或培养物中混杂的多种细菌分开成长为单个菌落，并根据菌落的形态和特征，挑选所需的单个菌落，经移种获得纯种细菌。不同的细菌在平板上所形成的菌落有其固有的形态特征，可以作为细菌鉴定的依据之一。14、平板划线方法分区划线接种法；曲线/连续划线接种法；棋盘格划线接种法；放射法；四格法；平板涂布接种法15、分区划线接种法：多用于含菌数量较多样本的细菌分离16、半固体培养基：可用于观察细菌动力和保存菌种。17、菌落：细菌经一定时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体(群落)。18、菌落特征菌落形状；大小：mm；表面性状；边缘情况；颜色；透明度；质地；粘度；乳化性......等19、细菌在鉴定培养基上的特征溶血特征；卵黄；蛋白；色素；气味在血平板上的溶血特征α溶血：狭窄的草绿色的半透明区域β溶血：完全透明清楚的宽带γ溶血：看不到溶血带的溶血卵黄琼脂中的反应：检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶卵磷脂酶：降解卵黄，菌落周围出现沉淀环脂酶：出现“珍珠包膜”蛋白水解作用：在菌落周围出现清晰的环。色素水溶性色素溶在培养基中，使培养基着色。绿脓色素、荧光色素等；脂溶性色素则使细菌菌落着色。金黄色葡萄球菌的金黄色菌落。气味假单胞菌属细菌→葡萄汁气味；变形杆菌→巧克力烧焦的臭味；链球菌→地窖里的霉臭；梭菌→粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌→辛辣味20、细菌的生化反应试验不同的细菌－→不同的酶系统－→不同的新陈代谢产物－→产物不同的生化特性－→鉴别细菌的类别21、糖发酵试验结果判断反应现象结果描述酸性变色、有气泡分解××糖产酸、产气酸性变色、无气泡分解××糖产酸、不产气培养基不变色不分解××糖22、甲基红(MR)试验：检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力。分解葡萄糖→丙酮酸→乳酸、乙酸、甲酸等→培养基的pH↓＜4.5＋甲基红指示剂→红色：阳性；分解葡萄糖→产酸少→培养基pH较高＋甲基红指示剂→黄色：阴性。23、β-半乳糖苷酶试验：预测细菌发酵乳糖的能力。β-半乳糖苷酶：一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。发酵乳糖的大肠菌类能产生β-半乳糖苷酶-渗透酶(P)和β-半乳糖苷酶(G)24、靛基质(吲哚)试验分解：蛋白胨中的色氨酸→吲哚吲哚＋二甲氨基苯甲醛→玫瑰吲哚(红色)25、硫化氢试验分解：含硫氨基酸→H2SH2S＋铅或铁离子→黑色硫化物。26、触酶试验过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。27、血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌可产生凝固酶,使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。玻片法：与细胞壁结合的凝固酶试管法：菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶28、血清学鉴定serologicalidentity：确定致病菌的种或型未知纯种细菌＋已知特异性抗体常用方法：玻片凝集试验、免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶免疫、间接血凝、乳胶凝集29、血清学诊断辅助诊断：抗原性较强的病原菌和病程较长的传染病。抗体有无及其抗体效价变化已知的细菌/特异性抗原＋特异抗体常用方法：试管凝集试验。直接凝集试验、显微镜凝集试验、沉淀试验、乳胶凝集试验、ELISA、免疫荧光试验等。急性期和恢复期双份血清样本，恢复期的抗体效价比急性期升高4倍或4倍以上。30、细菌毒素的检测方法外毒素细菌外毒素的免疫血清(抗体)＋被检细菌培养物滤液(抗原)细菌外毒素(抗原)＋被检患者血清动物试验内毒素家兔热原试验,鲎试验,免疫学方法、生物学方法、化学发光法、流式细胞术、高效液相色谱31、鲎试验(limulustest，LT)：定量及半定量检测细菌内毒素；血液中含有一种独特的有核变形红细胞，红细胞裂解物＋内毒素→凝胶外毒素与内毒素的主要区别特性外毒素内毒素来源革兰阳性菌与部分革兰阴性菌革兰阴性菌存在部分从活菌分泌出，少数细菌崩解后释出细胞壁组分，细菌死亡裂解后释出化学成分蛋白质脂多糖稳定性多不耐热，60～80℃，30分钟被破坏耐热，160℃，2～4小时才被破坏毒性作用强，对组织器官有选择性毒性效应，引起特殊临床表现较弱，各菌的毒性效应大致相同，引起发热、白细胞增多、微循环障碍、休克、DIC等抗原性强，刺激机体产生抗毒素；甲醛液处理脱毒形成类毒素弱，刺激机体产生的中和抗体作用弱；甲醛液处理不形成类毒素基因定位常由质粒、噬菌体等染色体外基因编码由染色体基因编码32、细菌数量的测定：物理计数法；生物计数法物理计数法细菌总数计数法：利用工具和仪器对样本中的细菌进行计数，其结果表示样本中的所有细菌(活菌＋死菌)。Breed计数法：Directmicroscopiccount比浊管计数法：细菌悬液的浊度与菌数成正比分光光度计