食品分析《维生素的测定》(第8章)

第8章：维生素的测定浙江科技学院生物与化学工程学院刘铁兵[e-mail]8AnalysisofVitamin浙江科技学院生物与化学工程学院刘铁兵[e-mail]食品分析概述1）维生素对人体的作用：维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。作为代谢的辅酶。这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。维生素的共性：•化学方法：•3）维生素分析方法：•水溶性维生素：B、C•脂溶性维生素：A、D、E、K•2）维生素的分类：•仪器方法：•微生物法：•生物鉴定法：1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。脂溶性维生素的测定脂溶性维生素具有以下理化性质：VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。耐热性氧化性VA好，能经受煮沸易被氧化（光、热促进其氧化）VD好，能经受煮沸不易被氧化VE好，能经受煮沸在空气中能慢慢被氧化（光、热、碱促进其氧化）耐热性、耐氧化性：皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。国际单位：IU（InternationalUnit)1IU=0.3μgVA=0.025VD=1.79μgβ-胡萝卜素=1.1mgα-VE=3μgVB根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常：2、维生素A的测定维生素A的结构：CH3CH3CH3CH2OHCH3CH3CH3CH3CH3CH2OHCH3CH3脱氢视黄醇视黄醇高效液相色谱法测定食物中VA、VE（GB/T5009.82—2003中第一法）高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。此法是同时测定维生素A和维生素E的方法。三氯化锑比色法测定VA基本原理：在氯仿溶液中VA能与三氯化锑生成蓝色可溶性络合物，在620nm有最大光吸收，其光吸收强度与VA浓度成正比。适用范围与特点：适用于高VA含量的食品；对低VA含量的食品因其它脂溶性成分的存在而受干扰；本法生成的蓝色络合物不稳定，比色必须在6秒内完成。试剂：无水乙醚：不含过氧化氢，检测方法：5ml乙醚加1ml10%碘化钾振1分钟，或再加4滴0.5%淀粉，水呈蓝色；去除方法：重蒸馏时，瓶内加入少许铁丝。（GB/T5009.82—2003中第二法）测定方法：样品处理：脱脂，用皂化法；皂化----提取----洗涤----浓缩；标准曲线绘制：样品测定：反应在比色皿中进行。注意事项：★乙醇为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象；★所用氯仿中不应有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰测定；故在每ml氯仿中滴加1滴乙酸酐，以保证脱水；★VA见光易分解，故整个操作要在暗处进行；★每国际单VA相当于0.3ugVA。注意事项：★样品中的β-胡萝卜素会干扰测定，可将干样品用正已烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮-已烷混合液为洗脱剂进行层析分离；★三氯化锑腐蚀性极强；★VA含量高的样品可直接加无水硫酸钠研磨后，加乙醚提取，加三氯甲烷溶解后即为待测的处理样品；★显色剂除用三氯化锑外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸。紫外分光光度法测定VA基本原理：VA的异丙醇溶液在325nm有最大吸收峰，其吸光度与VA含量成正比；适用范围与特点：灵敏度高，检测下限为5ppm，但325nm吸收干扰物质多；因此只适合于透明鱼油、VA浓缩物等纯度较高的样品；测定方法：样品----皂化----洗脱---脱水----蒸发---异丙醇溶解---325nm测定光吸收；胡萝卜素的测定VA的前体物质：类胡萝卜素；α、β、γ胡萝卜素，其中以β-胡萝卜素的效价最高，每毫克β-胡萝卜素相当于560国际单位VA。胡萝卜素只存在于植物性食物中；胡萝卜素对热、酸、碱比较稳定，但对紫外线和氧却不稳定，可将其破坏。胡萝卜素在450nm有最大吸收；但由于其常与叶绿素、叶黄素等色素共存，故要测定必须要分离出胡萝卜素。基本原理：以丙醇、石油醚提取出胡萝卜素，以石油醚为展开剂进行纸层析，由于胡萝卜素的极性最小，移动速度最快，从而与其它色素分开，取下此区带，洗脱后于450nm比色测定。通常用层析法分离测定胡萝卜素：β—胡萝卜素的结构如下：胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素。样品的提取与洗涤：注意植物油和高脂肪样品先要皂化；样品的浓缩与定容：在有氮气环境中浓缩，但不要浓缩得太干；纸层析：点样：在基线（距低端4CM处）上取四点，分别在二点间带状点样；展开：以饱和过的石油醚为展开剂，进行上行展开；洗脱：剪下胡萝卜素色带，置于5ml具塞试管中，用力振摇，使色素完全溶解；比色测定：以石油醚为空白，于450nm处比色测定；标准曲线的绘制：测定方法：★此法为国标方法，方法简单、最小检出限为0.11ug；★浓缩时要防止蒸干，同时要在充氮条件下进行；★层析分离也可用柱层析，效果好，但费时；★一般用专用的中速滤纸；（GB/T5009.83—2003）第一方法是HPLC；第二方法为纸层析法。说明与讨论：维生素D的测定概述：成人缺乏VD会患软骨病，儿童缺乏VD会患佝偻病；VD有多种，其中最重要的是VD2和VD3及其维生素D原，VD3只存在于某些动物性食物中。维生素D2无天然存在，维生素D2只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。1IU=0.025ugVD3VD测定方法有：比色法、紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析；比色法和HPLC法为AOAC推荐的VD测定方法。三氯化锑比色法测定VD基本原理：在三氯甲烷溶液中，VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，在500nm处的呈色强度与VD的含量成正比；样品测定：样品处理：当有VA与VD共存时，要进行分离，分离方法为：制备分离柱：分四层，依次为无水Na2SO4、聚乙二醇层、中性氧化铝层和无水Na2SO4；纯化：以石油醚为淋洗剂，弃去初滤液，收集一定量；然后用水三次洗以除去残余的聚乙二醇，避免与三氯化锑反应生成混浊物影响比色；然后再用无水硫酸钠脱水，之后用三氯甲烷溶解；测定：绘制标准曲线：样品测定：三氯化锑比色法测定VD★VD常与VA、VE、胆固醇等在一起，且量要大大超过VD，严重干扰其测定，因此要经柱层析去除这些干扰成分；★操作时加入乙酰氯可消除温度的影响；★此法不能区分VD2和VD3，测定的是二者的总和；说明与讨论：维生素E的测定概述：VE有八种，又称生育酚，属于酚类化合物；其中以α-生育酚的生理活性最高，分布也最广；动植物中均有分布，其中又以植物油料中为最多。主要测定方法有：比色法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱法；比色法操作简单，灵敏度较高，但由于VE无特异性反应，要采取一些方法消除干扰；荧光法特异性强、干扰少、灵敏、快速、简单；目前测定VE最好的方法为HPLC法。比色法测定维生素E基本原理：VE能将Fe3+还原成Fe2+，而Fe2+能与联氮苯发生颜色反应，可于520nm比色测定；测定操作：样品处理：皂化：于KOH的甲醇溶液中皂化，并在充氮气流中72-74℃皂化，然后加水乙醚萃取，再将萃取液经无水硫酸钠脱水；在二氧化碳气流中减压蒸干；纯化：用苯作洗脱液进行柱层析，洗至洗出液约25ml；若柱上出现微蓝色带则为类胡萝卜素；出现暗蓝色带则为VA；样品测定：FeCl3乙醇溶液、联氮苯乙醇溶液；放置10分钟；520nm；标准曲线绘制：★VE在碱性条件下易被氧化，因此需在N2气流中皂化，并可加入焦性没食子酸作为抗氧化剂；★处理前应将其它可使三价铁还原为二价铁的还原性物质去除；★发色剂除用联氮苯外，也可用4，7-二苯基-1，10-菲绕啉；★VE的各种异构体与试剂的反应速度、呈色强度各不相同；★VE见光易氧化，因此操作要避光。说明与讨论：水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可破坏大部分或全部。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。水溶性维生素的测定根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2盐酸水解酶解提取纯化维生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的保护作用。淀粉酶木瓜蛋白酶活性人造浮石硅镁吸附剂维生素B1的测定概述：VB1又名硫胺素，可与盐酸生成盐酸盐；通常以游离态，自然界常与焦磷酸结合成焦磷酸硫胺素（TPP）。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。VB1在机体代谢中具有重要作用，缺乏会引起脚气病、神经炎等。人体维生素B1的需要量为每天1～2mg。主要测定方法有：分光光度法、荧光法、高效液相色谱法；GB/T5009.84—2003中唯一的方法是荧光计法。荧光法测定维生素B1基本原理：VB1在碱性高铁氰化钾溶液中，能被氧化成一种蓝色的荧光化合物——硫色素，在没有其它荧光物质存在时，溶液的荧光强度与硫色素的浓度成正比。所含杂质需要用柱色谱法处理，测定提纯溶液中VB1的含量。操作步骤：（1）样品处理：（2）提纯：（3）氧化：（4）标准与标准空白制备：（5）测定：（1）凡士林有荧光，因此活塞上不能涂，可用甘油-淀粉代替；（2）一般样品中VB1有游离也有结合型，故需要用酸和酶水解；（3）谷物类不需要酶分解，样品经粉碎后用酸性氯化钾直接提取，氧化测定；（4）一般每克人造沸石能吸附30ugVB1，硫胺素量过大，回收率下降；（5）铁氰化钾的用量要适当，过多会破坏硫胺素，过少则硫胺素氧化不完全；（6）样液和标准液通过交换管的流速要一致，流速过快会因交换不彻底或吸附不完全而影响测定结果。说明：维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。分析方法：GB/T5009.85—2003中第一法为荧光法，第二法为微生物法。维生素B2的测定维生素C的测定概述：VC又名抗坏血酸，广泛分布于新鲜果蔬及绿色植物中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。VC在生物机体中起重要功能。固体VC比较稳定，但其水溶液极易氧化，氧化速度随温度升高pH增加而加快．维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成