食品安全及其检测技术

深圳大学研究生课程论文题目免疫技术在乳制品质量安全检测中的应用成绩专业生物医学工程课程名称、代码食品安全及其检测技术年级2016姓名李金方学号20164331008时间2016年6月任课教师吴序栎摘要：食品安全是关乎民生安全的重中之重，随着生活水平的提高，牛奶成了人民获取营养的一大来源，这一需求促进了牛奶企业的蓬勃发展，但是由于不法分子为了更高的利润向牛奶内添加化学物质应对安全检测，造成了恶劣影响及严重后果。本文主要就免疫分析技术在乳制品安全检测中的应用进行了探讨，以期在具体工作中有所裨益。关键词：牛奶；免疫分析技术；检测技术；1引言近年来发生了一些严重的牛奶质量安全事件，如“三聚氰胺”，这些问题让消费者对食品质量安全产生了担忧。应高度重视牛奶安全问题，完善检测技术，保障消费者的健康。因此，进一步加强牛奶的检测和监管，对于提高牛奶的质量安全具有十分重要的意义。免疫学技术具有简便、快捷、灵敏、高效、特异性强等优势，应用领域广泛，可用于检测食物中蛋白质、激素、药物残留、细菌、真菌、毒素及其他生理活性物质等。免疫学检测技术在牛奶质量检测分析中扮演着十分重要的作用。本文综合阐述几种常见免疫学技术在乳制品质量安全检测中的应用，介绍常用免疫技术在乳制品检测中的应用。2免疫分析技术的概况1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)，这一免疫测定技术的提出，扩张了免疫酶技术的应用范围，使免疫学技术应用于食品安全检测成为可能。随着免疫分析技术的发展，其主要包括非标记免疫分析技术和标记免疫分析技术，分别包括免疫扩散、免疫电泳；酶免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析、胶体金免疫技术、发光免疫技术和铁蛋白免疫技术等[1]。免疫分析技术最突出的优点是操作简单，速度快、分析成本低。免疫测定法取样量小，前处理简单、容量大，仪器化程度低，检测牛奶的灵敏度高。是目前奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测方法。3酶联免疫技术酶联免疫分析技术(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)问世以来，最早应用于黄曲霉毒素（AFT）的检测，黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，是二氢呋喃香豆素的衍生物[2-3]。目前发现的黄曲霉素有十几种，黄曲霉毒素M1(AFM1)是黄曲霉毒素B1的羟化代谢产物,1963年由Alleroft首先发现,1965年被命名为黄曲霉毒素M1。AFM1主要存在于动物的可食部分,如肝脏、肌肉、血液等,也可以通过尿液和乳汁排出。其理化性质很稳定,牛奶经过巴氏消毒,几乎不被破坏。AFM1具有强致癌性和致基因突变性。AFM1进入人体后,对血液、肝脏、肾脏、肌肉有不同程度的破坏,其中对肝脏和肾脏的危害最大。当与乙肝病毒共同作用于肝脏时形成倍乘风险效应,导致肝癌发生。另外,当婴幼儿乳品及母乳中含有AFM1时,对婴幼儿健康会造成很大影响,可以造成发育迟缓、肾功能降低、肝细胞癌早发甚至可能导致急性中毒死亡。近年来,世界各国纷纷制定了乳与乳制品中AFM1的限量标准。包括中国、美国和日本在内的许多国家规定奶及奶制品中AFM1的含量不得超过0.5μg/kg,欧盟制定的标准更为严格,为0.05μg/kg。其中,中国规定婴儿乳品及代乳品中AFM1不得检出[4-5]。由于黄曲霉毒素的限量要求低，但出现率高，因此需要采用准确灵敏的检测方法。酶联免疫分析技术，其基本原理是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定[6]。由于酶的催化效率很高，加强了初级免疫反应的效果，从而使此测定方法的敏感度大大提高。裴世春等[7]对直接竞争-ELISA快速检测乳品中的AFM1进行了研究。他们将辣根过氧化物霉(HRP)与高纯度抗AFM1单克隆抗体进行偶联。检测范围是0.015~4.05μg/L,添加AFM1至0.45μg/L的鲜奶样品中检测平均回收率为80%。梁迪思等[8]通过使用甲醇/水(1:1,v:v)提取再经三氯甲烷净化的处理方法,来对ELISA检测婴幼儿配方奶粉中AFM1含量方法进行改进。该方法的灵敏度为0.1μg/kg,相对标准偏差为6.57%,加标回收率为90.0%~105.6%。结果显示该方法重复性好,有效地降低了假阳性的出现。Kanungo等[9]提出超灵敏的夹心酶联免疫吸附法,将AFM1的大鼠单克隆抗体在384个微孔板上固定用来捕获AFM1抗原。然后再加入被辣根过氧化物酶标记的家兔二次多克隆抗体进行竞争反应,最后加入鲁米诺发光试剂进行示踪检测。预处理之后对不同脂肪百分比含量的牛奶进行分析。在3％的脂肪含量的牛奶中AFM1检测的线性范围为6.25~250pg/mL。这种分析方法只需样品10μL,能够对牛奶样品中的AFM1进行痕量分析,改进检测限为0.005pg/mL。4免疫胶体金技术免疫胶体金技术(immunecolloidalgoldtech—nique，ICGT)是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原一抗体反应的一种利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法。利用纳米金作为标记物,在5~10min内完成对样品中AFM1的检测[10]。具有快速、高效、操作方便等特点。整检测过程无需分离纯化样品,也无须对检测溶液做任何处理便且不需任何设备和仪器，只需制备好试剂盒或测试条即可。由于胶体金本身具有颜色，与ELISA相比省略了加显示剂和终止液的步骤，很大程度上简化了操作，更适合于野外或现场应。Wang等[11]用金纳米免疫层析试纸条检测牛奶中的AFM1,这种方法快速,适于现场快速检测。其对牛奶样品中的AFM1的检出限为1.0ng/kg,10min即可完成检测。孙翠萍等[12]依据胶体金免疫层析技术,研制出快速检测牛奶中AFM1的胶体金快速检测试纸条。该试纸条检测时间仅需10min,检出限为0.5ng/kg,假阴性与假阳性率均为0。李洁等[13]通过协同试验的方法证明用该方法检测牛奶中的三聚氰胺，检出限为0．5mg／L，但在实际检测中，待测样品本身所含有的杂质成分(如尿素，含N元素)会影响检测的准确性和灵敏度。由于该方法没有加入邻苯二胺、放射性同位素等有害的物质，所以不会造成环境污染，具有酶标或放射性同位素等检测方法所不可替代的安全性。5免疫-PCR技术免疫一PCR是把聚合酶链式反应和抗原抗体相结合的抗原检测技术，本质是聚合酶链式反应的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合而形成的检测技术[14]。氯霉素(CAP)是被禁止使用的抗生素，其通过在可食性动物中的非法使用进入食物链，人体摄入后有可能引起再生障碍性贫血。在牛奶中基于免疫磁珠技术对氯霉素离子进行定量检测的实时免疫定量聚合酶链反应(RT-IPCR)方法已经建立，检测浓度范围可达0．001～0．1μg/L。该方法可实现定性和定量的检测，特异性强、灵敏度高，能够进行大量样品的检测且污染少。免疫-PCR技术可以实现对乳制品中微生物的定量测定，提高对微生物的质量控制。Bhanurekha等[15]利用PCR技术对随机抽取的181个牛源奶样本进行鉴定，结果显示4个样品呈阳性含有结核杆菌，相比其他测试方法灵敏度更高。通过PCR方法能检测牛奶中的细菌，可用于奶牛细菌的实时监测。Dai等[16]利用PCR技术，通过聚甲基丙烯酸羟乙酯／酰胆碱包裹的免疫磁珠颗粒具有的高捕获能力，在5小时的蛋白胨中培养以后，将聚甲基丙烯酸羟乙酯／酰胆碱包裹的免疫磁珠颗粒应用于PCR检测中，沙门氏菌检出限为0．1CFU／mI，具有很高的检测限。6免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique，IFT)根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量[17]。目前葡萄球菌毒素、李斯特菌、大肠杆菌O157等的快速检测都可以用免疫荧光技术来完成。该技术的主要特点为特异性强、快速简便、灵敏度高及测试费用低[18]。免疫发光技术与电泳相结合相成的免疫荧光毛细管电泳技术，利用同源氯霉素荧光剂与氯霉素抗体竞争性结合，在标准缓冲液中检测到的最低氯霉素浓度为0.1-0.5ng/mL[19]。这种方法灵敏度高，用时短速度快，应该更广泛地应用于试验分析中。Giovana等[20]利用间接免疫荧光法检测牛乳中犬新孢子虫抗体，该方法特异性强、灵敏度高。随机抽112头泌乳奶牛的牛奶样品，检测发现约78％牛奶样品中含有犬新孢子虫抗体。但此方法还存在一些不足，如非特异性染色的问题未能完全解决，技术程序比较复杂等。7放射免疫技术放射免疫技术（radioimmunoassav，RIA），其原理是将放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。*Ag为同位素标记的抗原,与未标记的抗原Ag有相同的免疫活性，两者以竞争性的方式与抗体Ab结合，形成*Ag-Ab或Ag-Ab复合物,在一定反应时间后达到动态平衡。如果反应系统内加入的*Ag和Ab的量是恒定的,且*Ag和Ag的总和大于Ab有效结合点时,则*Ag-Ab生成量受Ag量的限制。Ag增多时，Ag-Ab生成量也增多，而*Ag-Ab生成量则相对地减少,同时游离*Ag也增多。因此,*Ag-Ab与Ag的含量呈一定的函数关系。如采用一种有效的分离方法，将*Ag-Ab和Ag-Ab复合物(以B表示)与*Ag、Ag(以F表示)分离,并测定B和F的放射性,可有以下规律:如样品中Ag增多，则B的放射性降低，F的放射性增高，即Ag与B成反比。计算B/F或B/T值(T=B+F),即可算出样品中Ag的含量。由于RIA是以放射性标记与非标记抗原竞争性地与抗体结合为理论基础，故又称为竞争性放射饱和分析法[21]。闫磊[22]等人应用CharmlI放射免疫分析方法检测牛奶样品中黄曲霉毒素，对牛奶样品加标0．25g/kg和0．50g/kg各进行18次，测定精密度为1．1％和1．3％。陆勤[23]等人用CharmlI放射免疫分析方法检测牛奶样品中四环素，在阴性牛奶中加入不同浓度的四环素，取不同浓度样本平行测试6次，结果表明四环霉素、土霉素、金霉素在添加水平30、100、50微克/L时结果显示阳性，证明3种四环素在该检测水平可被100%检出，且变异系数小。用四环素、土霉素、金霉素、强力霉素4种四环素配成混标加入空白牛奶，使四种四环素浓度分别为25微克/L3次平行实验结果均为阳性。因此可以认为，四环素类药物总的检测限可达到100微克/L，符合我国、日本、欧盟对牛奶中四环素类抗生素检测限100微克/L的要求。放射免疫法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等，常可测至皮摩尔。本法虽然也用放射性物质，但一般都是在测试样品时再加入标记的同位素示踪物，此示踪物的放射性强度极低，一般不会对实验者引起辐射损伤、对环境造成污染。本法的缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等。8发光免疫技术发光免疫技术（uminescentimmunoassay;LIA）,是将发光分析和免疫反应相结合所建立起来的一种新的超微量分析技术。它是继放射免疫和荧光免疫之后的又一新技术，是一种非放射性的测量方法。这种方法兼具有发光分析的高敏感性和免疫反应的高特异性。在发光免疫分析中，有两个反应系统即免疫反应系统和发光免疫分析。免疫反应系统的基本原理基本上与放射免疫相同。发光免疫分析根据发光反应的不同体系(化学发光体系或生物发光体系)和发光物质标记方法的不同可以分为三类：①化学发光免疫