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新型促红细胞生成素研究现状【摘要】促红细胞生成素(EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素,用基因工程方法生产的重组人红细胞生成素在治疗肾性贫血及其他类型的贫血等方面有很好的疗效。本文综述了近年来各种新型促红细胞生成素的研究现状及市场前景。【关键词】促红细胞生成素促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素,它主要来源于肾脏(少量来源于肝脏),由皮质管周围的间质细胞合成。在基因重组技术诞生之前,EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取,得率非常低,且极不稳定,理化和生物学性质难以测定,亦无法大规模应用。1985年Lin等首先从人类基因库中分离EPO基因,测定其核苷酸序列,并在哺乳动物细胞中获得表达。1989年美国Amgen公司在国际上首次研制成功重组人红细胞生成素(rhEPO),用于治疗肾性贫血,取得了令人瞩目的疗效[1]。EPO在癌症相关性贫血(CRA)[2]、自身免疫性疾病伴发性贫血[3]、骨髓增生异常综合症(MDS)、再生障碍性贫血(AA)、单纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、慢性髓系白血病(CML)、特发性骨髓纤维化(IMF)、溶血性贫血、造血干细胞移植、艾滋病引起的贫血和化疗引起的贫血及用于择期手术的自身输血血液储备等方面也有一定疗效。应用EPO可减少输血及提高病人生活质量,但因应用其治疗需大剂量频繁给药,给病人经济上及生活上带来诸多不便。目前已有不同策略用于提高EPO的产量和内源活性以及研制其他促红细胞生成素。如EPO融合蛋白(EPOfusionprotein)、新红细胞生成刺激蛋白(novelerythropoiesisstimulatingprotein,NESP)、造血细胞磷酸酶(haematopoiesiscellphosphatase,HCP)抑制物、EPO模拟肽(EPO2mimeticpeptide)、EPO基因治疗等。1EPO简介人类EPO含有166个氨基酸,相对分子质量为34400,有4个糖基化位点,其中3个N2糖基化位点(Asn24,38,83)和1个O2糖基化位点(Ser126),并有2个二硫键连接。其中60%是蛋白质(单个多肽链),40%为糖类。糖基化对稳定EPO的体内活性具有重要作用,若缺乏糖链,则EPO在体内迅速被水解而失活。天然存在的EPO分为两种类型,α型含34%的碳水化合物,β型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。EPO主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。展望自1989年6月美国FDA批准Amgen公司的rhEPO上市,到2001年Amgen公司长效EPO(Arane2sp)上市的10年中,世界EPO市场竞争非常激烈,中国国内的生物医药企业也纷纷研制开发EPO产品。Amgen公司的Epogen/Procrit(α2促红细胞生成素)已在全世界40多个国家销售,成为有史以来各类生物技术医药产品在市场开发中最为成功的实例。其他品牌还有日本麒麟公司的利血宝(Espo)、德国宝灵曼公司的生血素(Recormon)。2001年6月底,Amgen公司的长效贫血治疗药Aranesp(darbepeotinalfa)获得欧洲药物评审委员会批准,至此,贫血治疗药市场的竞争愈演愈烈。其后不久,Roche公司宣布了其用于肾衰贫血治疗的NeoRecormon的临床研究结果,称其疗效与Aranesp相近,且可使用Reco2Pen自行给药[19]。有关统计表明,我国肾衰患者现有近100万人,而且大多伴有肾性贫血。因而EPO国内市场容量非常大。国产EPO于1997年初获得了卫生部的批准,并在当年下半年正式投产上市。国产EPO的问世打破了美、日、德等国对此产品的垄断[20],但目前国内还没有新型促红细胞生成素上市。21世纪是生物技术突飞猛进的年代,目前全球医药市场上将有近100种生物工程技术的药物品种上市,总销量将超过200亿美元。我国生物制药近年的发展势头迅猛,生物医药制品的用量在未来数年内将以超过12%的速度增长,这一态势将有利于我国生物医药产品的开发。国内制药企业若注意研发高水平的EPO制剂技术及开发新剂型,必将在该领域取得突破性进展。重组人促红细胞生成素的制备与临床应用摘要本研究主要探讨采用中国仓鼠卵巢细胞来生产重组人促红细胞生成素rhEPO,该类细胞株的稳定性好并且有较高的表达效率,rhEPO的理化性质和生物学特性与人尿的促红细胞生成素EPO没有差别,其在临床应用上对治疗肾性贫血有较好的万效,同时其对非肾性贫血的治万也有良好前景。用基因重组法生产红细胞生成素(EPO)关键词重组人促红细胞生成素日本雪印乳业公司与京都大学农学部协作研究,发明了用基因重组技术生产EPo的有效方法。EPO是一种糖蛋白质增血激素,作为未来的增血剂而引人注目。以小鼠L一929细胞为宿主,使用病毒Sv一40中组入了EPo基因的载体时,80%的转化细胞能产生EPO,多代培养后产生能力仍稳定。该研究组已开发成功使用单克隆抗体从贫血患者的尿中高纯度精制EPo的技术,1984年已作为实验试剂出售,但是用作增血剂还必须确立大量生产方式以便工业生产。所以,他们以前述方法作为大量生产EPO的线索,进一步往实用化方向深入研究。重组人促红细胞生成素中试纯化工艺研究摘要采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌rhEPO的工程细胞株XP9501。所收集的上清液,经过快速离子交换层析)反相)分子筛层析纯化后,所得EPO纯度达99%以上,比活性为115@105IU/mg。整个纯化全过程的EPO体内活性回收率为46%。所纯化的EPO分子量为36kd,等电点为315。免疫印迹证明其有天然EPO的免疫原性,N端15个氨基酸序列分析与文献报道一致。本纯化工艺路线简单,时程短,重复性好,适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。关键词重组人促红细胞生成素(rhEPO)纯化工艺促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一种糖蛋白激素,能刺激红系祖细胞分化发育成成熟的红细胞[1]。EPO产生于人的肾及胎儿的肝脏[2]。早期的EPO主要从尿中提取,用于治疗肾功能衰竭引起的贫血[3]。现已可用重组DNA技术大量生成,并使用于临床,产生了可观的社会效益和经济效益。本文报道我们用无血清培养基在堆积床生物反应器中培养工程细胞株XP9501(CHO),培养上清经离子交换-反相-分子筛三步层析,得到高纯度高比活性的EPO。该工艺重复性好,时程短,可用于大规模生产EPO供临床使用。rhEPO生产用工程细胞株XP9501(CHO)由中国预防医学科学院病毒学研究所韩锋等构建[4]。细胞扩增使用含10%胎牛血清和5@10-7氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)的DMEM培养基(GIBCO)。生产用培养基为无血清培养基CHO-S-SFMII(GIBCO)。重组人促红细胞生成素的研究进展人促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO），是一种高糖蛋白类激素，也是最早发现的细胞因子之一。EPO主要是在肾脏合成分泌，进入血液循环系统，作用于骨髓中的红系祖细胞，促进红系祖细胞增殖、分化和成熟为红细胞。它能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量，从而提高血液的携氧能力，增强机体对氧的结合、运输和供应能力，改善缺氧状态，是哺乳动物调节红细胞生成的主要调控因子。1989年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Amgen公司生产的rHuEPO上市，在临床上主要用于治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。继重组人促红细胞生成素（rHuEPO）出现之后，出现了很多新型的EPO，如新促红血球生成蛋白NESP(newerythropoietinstimulatingprotein，亦称高度糖基化Epo-Darbepoetin），CERA，EPO模拟肽EMP（EPOmimeticpeptide）等，为临床治疗提供更好的条件。rHuEPO自从上市以来，rHuEPO可以减少病人输血次数，提高病人的生活品质，成为迄今为止用基因工程代替体液因子治疗人类疾病的一个最成功的范例之一。1.人促红细胞生成素的发现人们对EPO的认识可以追溯到上个世纪初，1906年Carnot和Deflandre发现：将放血后兔子的血浆注射给正常的兔子，正常兔子的外周血中的红细胞数量增多。他们认为贫血兔血浆中存在一种体液因子能够刺激红细胞生成,并称其为生成素[1]。这对EPO的发展无疑是一项突破。1948年，Bonsdorff和Jalavisto等将这种调控因子命名为红细胞生成素。1950年Reissman用连体鼠试验观察到，给连体之一呼吸低氧空气，另外一只鼠呼吸正常空气，结果两只均呈现同样程度的骨髓红细胞增生现象，这是由于红细胞生成素从低氧鼠进入非低氧鼠从而刺激红细胞的生成。这大大鼓舞人们对EPO的兴趣。1977年Miyake等人从再生障碍性贫血患者的尿液中成功分离提纯人红细胞生成素[2]。在基因工程技术出现以前，人们就是一直利用从贫血病人尿中、山羊和兔子中提取的EPO治疗贫血，可是通过这种方法提取EPO效率非常低，而且极不稳定，临床应用范围窄。1985年Lin和Jacobs等人分离了人EPO基因的cDNA和基因组DNA，并将EPO基因成功转入中国仓鼠卵巢细胞得到高效表达[3-4]，加快了人们对EPO的基础研究，为重组人促红细胞生成素进入临床提高可能。1989年，美国FDA批准rHuEPO上市，主要应用于肾功能衰竭贫血患者的治疗。临床试验证明：rHuEPO不仅对肾性贫血有很好的疗效，而且对非肾性贫血如炎症、肿瘤、化疗及移植后贫血的治疗也有广阔的应用前景。根据2010版的生物制药市场分析可知：自1989年批准rHuEPO上市以来,现在总共有8种rHuEPO批准上市，大多都是生物仿制药，rHuEPO一直是全球销售量最大的基因工程药物，每年年销量额都超过百亿美元。2.EPO的来源胎儿肝脏是胎儿EPO的主要合成器官[5]。而成年以后肾脏则变成EPO合成的主要场所[6-9]。自1985年EPO基因的成功克隆，人们利用EPO基因cDNA探针进行原位杂交，以及免疫组化方法来确定EPO的生成场所，研究发现肾脏是EPO合成分泌的主要器官[10]。现已明确在肾脏中主要是由肾小管及管旁毛细血管内皮细胞及间质细胞合成分泌。Koury等人研究发现成年机体中有大约10-15%的EPO是由肝脏生成[11]。在肝脏中，EPO主要是由肝中央静脉周围肝细胞及肝枯否细胞产生。此外还有研究发现EPO亦可经一些肾脏和肝脏肿瘤、脑血管瘤、子宫肌瘤及卵巢囊肿等合成[12]。3.EPO的结构及其生物学作用3.1EPO的结构人类EPO基因位于7号染色体长臂22区(7q22)[13-15]，全长3000个碱基，含有5个外显子和4个内含子，与鼠源EPO基因序列有85%的同源性，与猴子EPO基因的同源性有95%。他们的EPO基因的同源性不仅表现在编码的氨基酸序列，同时在5'端第一内含子和3’端非编码区高度同源[10]，这种序列上的高度保守性可能与EPO基因表达调控有关。1992年研究表明在EPO基因3’端侧序列上存在顺式作用元件，该作用元件与机体氧含量有关，即为低氧诱导增强子，该低氧诱导增强子大约有50bp碱基，可特异与HIF-1和HIF-2结合。研究发现EPO基因表达的时间特异性和空间特异性，则是由GATA转录因子家族的转录因子结合在5'端启动子区域调节EPO基因的表达[16]。正常生理条件下，血液中的EPO浓度维持在5～20mU/ml。当循环血液中红细胞容积减低或机体缺氧时，HIF-1和HIF-2与低氧诱导增强子结合，上调EPO基因表达，使机体的EPO维持在正常水平[17-18]。此外，低血糖、细胞内钙浓度的增高、雌激素、雄激素、肾上腺素以及一些免疫调节因子亦参与调节EPO生成。人体编码的EPO是一种糖蛋白类激素，相对分子质量为34000Da.由单链多肽分子骨架和糖基两部分组成。EPO基因编码的多肽为193个氨基酸，N端的27氨基酸组成的