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重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达及超声破碎一．实验目的：(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。(2)了解降解物阻遏的现象及其机理。二．实验原理：本实验使用的是载体是已重组好的pQE31-BTI，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为荞麦胰蛋白酶抑制剂GBTI，非目的蛋白即融合部分为标签6×His，可用于亲和层析分析。本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。(1)诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导，如下图3所示：乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。(2)葡萄糖降解物的阻遏作用代谢物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein）CAP，又称cAMP受体蛋白属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合DNA促进乳糖操纵子的转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。本实验使用的表达载体pGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带6×His的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属螯合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。三．材料与试剂：(1)材料工程菌：BL21(DE3)Pet28a-pod(2)试剂LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeastextract）5g、NaCl10g，加800mL双蒸水溶解，用10MNaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。分装，高压灭菌，4℃保存。卡那霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃保存，使用终浓度为50μg/mL或100μg/mL。IPTG溶液（100mM）：将238.3mgIPTG溶解于10mL双蒸水，0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用，贮存浓度为100mM。超声平衡缓冲液：50mMTris-HCl,pH7.0四．实验仪器：超净工作台、低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。五．实验步骤、现象、结果及分析：1.挑取BL21(DE3)pET28a-pod的单菌落接种到5mlLB液体培养基（含卡那，终浓度为100μg/mL）2.诱导表达1#不需处理，2#加入5μLIPTG至终浓度为0.1mM，于37℃、250rpm培养4h。3.收菌破碎细胞菌液分别收集到2个1.5mLEp离心管中(收3次），编上相应编号。离心，弃上清(10000rpm离心1min)。加入缓冲液Tris-HCl(pH7.3,50mM)，超声波破碎，离心，取上清。4.SDS-PAGE鉴定重组蛋白是否表达及其分子量