重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达鉴定

1重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定2【摘要】目的：利用PCR技术[1]扩增hIL-8cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。方法：PCR技术扩增hIL-8cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果：带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。【关键词】hIL-8，PCR，重组DNA3【Summary】Purpose：ConnectingthehIL-8cDNAwhichisamplificatedusingPCRtechnologywiththeplasmidofprokaryoticexpressionvectordigestedpKpL3a(includingPLpromoter),anddetectingtheexpressionandidentificationofrecombinanthIL-8inE.coli。Method：GettargetgenebyamplificatinghIL-8cDNAusingPCRtechnology.ExtracttheE.coliplasmid.ConnectthetargetgenewithE.coliplasmidpKpL3aexpressionvector.TransformrecombinationDNAintoE.coliPop2136,andregulategeneexpressionofexogenoususingthetemperature-sensitiveλrepressorprotein,thendetecttheexpressionlevelsbyELISAreaction。Result：RecombinantplasmidPKpL3awithhIL-8geneissuccessfullytransformedintoE.coliPop2136andexpressesIL-8.TheexpressionleveloftheIL-8isdetectedbyELISAreaction.Conclusion：hIL-8issuccessfullyexpressedinE.coli.【Keywords】hIL-8，PCR，RecombinationDNA4白细胞介素8（Interleukin-8）是一种具有趋化作用的细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产[2]。本实验通过PCR获得IL-8的c-DNA，将其连接于原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）中，用温度诱导表达技术使外源基因得以表达。1材料与方法1.1材料试剂⑴模板（cDNA文库，CLONTECH公司）；大肠杆菌（含pKpL-3a质粒）；⑵上游hIL-85ˊ引物（agtgctaaagaacttagatgtTm=56℃，由Takara公司合成）；下游hIL-83ˊ引物（ccgtctagattatgaattataagccctctTm=56℃，由Takara公司合成）；⑶酚-氯仿-异戊醇；NaAc；70％乙醇，无水乙醇；⑷缓冲液A（50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl，pH8.0）；碱溶液；乙酸缓冲液；TE缓冲液；RNA酶A溶液；⑸TAE电泳缓冲液；GEBS样本液；溴化乙锭；⑹LA培养基；LA培养皿；100mMCaCl2；⑺包被抗体（抗IL-8单克隆抗体）；酶标抗体（酶标记IL-8单克隆抗体）；标准品（rHuIL-8，200ng/ml）；包被缓冲液（Ph9.60.05MCBS）；抗体稀释液（pH7.20.01MPBS）；洗涤液（pH7.20.15MPBS）；稀释液（pH7.20.15MPBS）；封闭液（牛血清白蛋白）；底物液（A液：TBM，B液：3％H2O2）；终止液（2mol/LH2SO4）⑻工具酶TaqDNA聚合酶及其buffer：北联生物医学工程公司；dNTPmix：Takara公司；Klenow酶：北联生物医学工程公司，1U/μl；内切酶StyⅠ、XbaⅠ：Takara公司，﹣20℃保存；T4DNA连接酶及其buffer：Takara公司1.2仪器PCR仪，微量加样器（20μl、200μl、1000μl），台式高速离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，37℃孵箱，酶标仪，一次性酶标板51.3实验方法⑴PCR技术扩增[3]hIL-8cDNA①在0.2ml反应管中加入下列成份：ddH2O4μl、10×buffer5μl、dNTPmix5μl、模板2μl、5ˊ引物2μl、3ˊ引物2μl、Taq酶10μl，构建总量为20μl的反应体系。②在设定好的PCR仪上进行反应（95℃，3分钟；95℃，30秒；52℃，30秒；72摄氏度，30秒），反应35轮，72℃，6分钟。③反应结束后取出8μl进行琼脂糖凝胶电泳，向管中余下的12μl反应体系中加入Klenow酶1μl，室温30分钟，以修平扩增片段的3ˊ末端。④转至1.5ml离心管中，加入50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，离心10000rpm，30秒。⑤吸取上层清液，转至另一已加入5μl3MNaAc的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，-20℃放置30min。⑥离心10000rpm，5分钟，弃上清，加入0.5ml70%乙醇，10000rpm离心，5分钟，弃上清，空气中干燥，溶于20μlTE。⑵质粒提取①从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。取菌液1ml转至Eppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。②加入200μl缓冲液A，充分混悬细菌。③加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。④加200μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。⑤离心10000rpm，2分钟，上清转至另一Eppendorf管中。⑥加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时。⑦离心10000rpm，5分钟，弃上清，加入70%乙醇0.5ml。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，弃上清，干燥。⑧加入50μlTE，使质粒溶解，酶切备用。⑶限制性内切酶消化①取两个Eppendorf管分别标记A、B后加入以下试剂，A管：ddH2O14μl、10×Mbuffer2μl、0.1%BSA2μl、PCR产物1μl、XbaⅠ1μl；B管：ddH2O16μl、10×Hbuffer2μl、质粒DNA1μl、StyⅠ1μl。②37℃水浴45分钟。③A管中加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心2分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底30min，10000rpm离心5分钟，弃上清，500μl70%乙醇洗一次，10000rpm离心2分钟，弃上清，干燥，加20μlTE进一步用于连接反应。④B管中加入1μlKlenow酶、2μldNTPmix，室温放置30分钟。加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心5分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时，10000rpm离心5分钟，弃上清，500μl70%乙醇洗涤一次，6干燥。将沉淀溶于15μl水中，加入2μl10×Mbuffer、2μl0.1%BSA、1μlXbaⅠ，37℃水浴30分钟。⑤B管加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心5min，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底30min，10000rpm离心5min，弃上清，500μl70%乙醇洗涤一次，干燥，加20μlTE，进一步用于连接反应。⑷DNA琼脂糖凝胶电泳①0.8%琼脂糖凝胶板的：取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3min，将其冷却至55℃-65℃，倒入制胶槽中。②充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。③DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。④稳压电泳80v约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5V/cm。⑤取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。⑥在凝胶成像仪观察结果。⑸DNA连接[4]①在Eppendorf管中加入下列物质进行连接反应：H2O9.5μl、10×T4DNA连接酶buffer2.5μl、pKpL3αDNA7μl、IL-8PCR产物5μl、T4DNA连接酶1μl。②置16℃水浴反应过夜。③65℃水浴15分钟，灭活T4DNA连接酶，用于转化。⑹转化①将无质粒大肠杆菌pop2136接种于1mlLB培养基，37℃培养3-5小时。②待OD600=0.4时，转移至Eppendorf管中，离心8000rpm，2min，弃上清。③加200μl100mMCacl2，混匀，置冰浴30分钟。④加10μl连接好的质粒DNA，混匀，置冰浴30分钟。⑸37℃水浴2分钟，冰浴2分钟。⑥加入1mlLB培养基，37℃培养20min。⑦取出100μl涂于LA培养皿上，37℃倒置培养过夜。⑧检查转化菌是否生成(只有转化的细菌才能在平皿上生长)。⑺细胞因子的测定—ELISA双抗体夹心法①包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，放置湿盒中，4℃，过夜。②封闭：洗板3次，加封闭液，200μl/孔，放置湿盒中，37℃30min。③待检样本：洗板3次，加入待测样品，阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，放置湿盒中，37℃30min。④加酶标抗体：洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，放置湿盒中，37℃30min。⑤显色：洗板3次，加入显色液，A液一滴，B液一滴。室温或37℃显色5-10min。⑥加终止液一滴。⑦酶标仪测450nm处OD值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。72结果2.1DNA琼脂糖凝胶电泳见图11组2组3组4组图1DNA琼脂糖凝胶电泳图注：PCRProducts:228bp本小组为第1组，扩增结果显示一致的扩增区带，PCR产物与设计的228bp相符，并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。2.2转化结果见图2本小组为第1组，转化结果显示，LA培养基上培养出散在的透明菌落，说明目的基因hIL-8cDNA与质粒表达载体pKpL-3a的连接是成功的。82.3ELISA双抗体夹心法检测IL-8含量所测OD值和标准曲线见表1和图3表1450nm处OD值123456789101112AB0.1730.1080.1160.1040.0990.0990.1020.113标准品1C0.1410.1220.1580.1040.110.1020.0940.098标准品2D0.1280.1250.1210.083样品1E0.1490.1250.1190.152样品2F0.3950.394+对照G0.0820.094-对照H图3标准曲线0.173,200.108,100.116,50.104,2.5y=255.09x-24.5020510152000.020.040.060.080.10.120.140.160.180.2标准品450nmOD值标准品浓度（ng/ml）线性方程为y