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试卷密号：试卷密号：考试科目：文献综述吉林大学研究生课程考试试卷学位级别：硕士考试科目：文献综述学科、专业：兽医公共卫生学院、中心：动物医学学院姓名：吴宗澄学号：2013852055考试时间：题号分数阅卷人12345678910总分注意：此半页各项考生不得填写注意事项1.以上各项除试卷密号之外必须填写清楚2.答题必须写清题号3.字迹要清楚、保持卷面清洁4.试题随试卷交回5.草稿纸另发，考试结束后统一收回6.阅卷时由研究生处按虚线将右半页裁下另编试卷密号回答内容食源性寄生虫检测方法的研究王楠吉林大学人兽共患病研究所摘要：食品安全是事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题，但食品中寄生虫(卵)污染所引起的食源性疾病流行，一直未得到足够的重视。面对日益严重的肉类及水产品中寄生虫的食品安全问题，大力研究和发展新型、快速、灵敏、集成、高通量的检测技术，己成为一个重要方向。而现有的检测方法还仅仅局限于病原学检查和寄生虫免疫学诊断技术，只能在患者发病后才能做到，此时只能治疗而不能预防。因此，建立食品中主要寄生虫的快速检测方法是很有必要的。关键词：食源性寄生虫；变性高效液相色谱；实时荧光PCR；基因芯片Researchoffood-borneparasiticdetectionmethodNanWang.JilinUniversityInstituteofZoonosisAbstractContent:Foodsafetyisrelatedtothehealthofthepeopleandbuildaharmonioussociety,whichisthemajorstrategicissues,buttheparasitesinfood(egg)pollutioncausedbyfood-bornediseaseepidemic,hasnotbeengivensufficientattention.Facedwiththegrowingproblemofparasitesinthemeatandaquaticproductsfoodsafetyissues,vigorousneedresearchanddevelopofnew,rapid,sensitive,integrated,high-throughputdetectiontechnology,hasbecomeanimportantdirection.Whiletheexistingdetectionmethodsarelimitedtocheckandparasiticpathogenimmunediagnosistechnology,canonlybedoneaftertheonset,butcan’tforprevention.Therefore,theestablishmentofparasitesinfoodprimarilytherapiddetectionmethodisverynecessary.Keywords:Food-borneparasites;DHPLC;Real-timePCR;Genechip食品安全是当今世界人们所关注的焦点问题之一，每年因食用不安全的食品而致使数亿人患病，造成许多人死亡。因而，食品安全已成为全球公众健康优先考虑的问题。食品安全性的优劣直接影响到一个国家乃至整个国际社会的经济、政治稳定。食品中的有害生物主要包括细菌、病毒和寄生虫。Mead等[1]报道，7%的食源性疾病是由寄生虫引起。寄生虫病是一种人兽共患病，它不仅危害动物，也对人类的身体健康带来很大危害。食源性寄生虫病是指进食生鲜的或未经彻底加热的含有寄生虫虫卵或幼虫的食品而感染的一类疾病的总称[2]。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食来源和方式的多样化，由食源性寄生虫病造成的食品安全问题愈加突出，食源性寄生虫病已成为影响我国食品安全和人民健康的主要因素之一[3]。目前，食源性寄生虫病在城市有增加的趋势。这种寄生虫病可分为五大类，共有30余种，例如植物源性寄生虫病，如姜片吸虫病；肉源性寄生虫病，如旋毛虫病、绦囊虫病、弓形虫病；螺源性寄生虫病，如广州管圆线虫病；淡水甲壳动物源性寄生虫病，如肺吸虫病；鱼源性寄生虫病，有华支睾吸虫病、棘鄂口线虫病、异型吸虫病、棘口吸虫病、阔节裂头绦虫病等。其中以华支辜吸虫病最为常见，其病原体为华支皋吸虫，因寄生部位为肝胆管，故又称肝吸虫[4]。1.常见食源性寄生虫及危害食品中最常见的鱼源性寄生虫为华支睾吸虫，主要由生食鱼、虾等水产品而感染的。食品中常见的肉源性寄生虫包括弓形虫、旋毛形和绦虫等，肉源性寄生虫常寄生于畜肉中，热衷于吃生的或通过烧、烤做法吃带血丝的猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅等和野生动物的人易感染肉源性寄生虫病。由于各种因素导致的鱼源性和肉源性寄生虫病影响的国家范围之广、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的，不但给人们的健康带来危害，而且还给国家间相关的食品贸易带来危机。2.食源性寄生虫检测技术研究进展寄生虫的检测方法可以归纳为三种，常规病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测技术。常规病原学检测技术，一般是在待测样品中组织去材通过直接镜检或染色后镜检以观察到寄生虫或虫卵为依据，有的检查还需对寄生虫体外培养或进行动物接种后再行病原学检查。镜检方法受制于技术人员的技术熟练程度和鉴别经验。因为食源性寄生虫的囊蚴、虫卵较小，易造成漏诊；其形态、大小也较接近，又难以分辨。有些吸虫尽管有大小差别，但变异较大，因此依据大小难以准确鉴别，从而易造成误诊；镜检法有时不能发现处于中间宿主发育阶段的吸虫[5]。免疫学检测技术，血清抗体检测在区分现症感染与既往感染上无能为力；血清循环抗原(CAg)检测，敏感性低，交叉反应高，影响因素多，至今尚无一种较理想的血清循环抗原检测方法。由于较难获得高特异性、高敏感性的诊断抗原，或者难以取得纯度高的特异性抗原，目前常采用免疫学方法进行检测，但现有的ELISA法敏感性或特异性不高[6]。分子生物学检测技术，目前应用在寄生虫检测方面的分子生物学技术主要包括普通PCR、多重PCR、PCR-ELISA、巢式PCR、实时荧光PCR和基因芯片等。最常用的是聚合酶链反应(PCR)，随着分子寄生虫学研究的深入发展，PCR及其相关技术在寄生虫检测方面的应用日益广泛，其原理在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依靠DNA聚合酶的酶促合成反应，扩增模板DNA所含有的特定基因。该技术能够从少量的寄生虫材料中扩增出目的基因或基因片段，克服了常规技术难以从一些寄生虫中和寄生虫不同发育阶段中获得或收集到足够量的材料，提高了检测的敏感性和特异性。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。3.寄生虫检测中的应用3.1实时荧光PCR技术在寄生虫检测中的应用实时荧光PCR技术正被用于识别寄生虫和诊断寄生虫病以及测定生物标本中寄生虫的水平，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等。在寄生虫学中最常用的方法是Taq-Man探针。如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水、以及脑脊髓液中的弓形虫定量，其检测极限相当于非实时的套式PCR，但准确率大大提高。HierlT等人[7]对实时定量PCR用于弓形虫检测给与较高评价，认为该方法检测弓形虫感染有着敏感、特异、快速、能考核感染度等诸多优点。荧光定量PCR技术应用于疟原虫的诊断，其敏感性、稳定性是以往其他检测技术无法比拟的，并且由于实行完全闭管式操作，能大大减少扩增产物污染的机会，提高检测的特异性，并可通过电脑自动读数对扩增产物进行精确定量。江晓玲等[8]将FQ-PCR技术用于疟原虫的检测，根据恶性疟原虫SSUrRNA基因序列，设计并合成引物和荧光标记探针。应用多元PCR(TaqMan探针/ABI7700)检测小鼠的肝期约氏疟原虫以评估红前期疫苗效力时，类似地非多元系统也被用在检测子孢子接种后小鼠肝期约氏疟原虫。另外，检测羊水中弓形虫时还使用了一个以FRET为基础的多元LightCyclerTM分析，其检测精度达10个虫/mL，可用于先天性弓形虫病的诊断。TaqMan多重PCR可以定量实验感染小鼠的婴儿利什曼原虫。实时定量PCR技术很还可用于定量低水平虫体负荷，从而考察无症状时的疫苗效力、药物治疗时感染的进展以及带虫者的诊断、对感染同一种寄生虫的不同基因型的虫体进行计数等。此外，无论是对寄生虫还是宿主对感染的反应，RNA水平定量在基因表达的研究中也很有价值。荧光PCR技术自建立以来，发展迅速、应用广泛，表明其具有强大的生命力。近些年来，许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深入的研究和改进，使荧光PCR技术得到了进一步地完善，并在此基础上开发出了许多新的荧光PCR技术。随着荧光PCR技术的不断发展该技术将在生物学和医学基础研究、农业、疾病诊断、新药开发、食品、环保等广泛的领域中得到更加广泛的推广应用。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且采用了完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染，配以相应的荧光PCR仪，整个PCR过程可实现自动化，且耗时短，操作方便，较之传统的定量方法劳动强度小，易于标准化和推广应用。因而迅速在医学，检验检疫，军事，农业，科研等领域得到了推广应用。3.2变性高效液相色谱技术的应用DHPLC这一新兴的变异检测技术一经诞生，即被许多国内外实验室采用，大多用以筛选候选基因中已知或未知变异。在最早成功地筛选出乳腺癌、卵巢癌相关基因（BRCA1）的突变后[9]，现DHPLC已被用于肿瘤相关基因（TSC1、TSC2、ATM、p53等）、先天性长QT综合征（KCNQ1、KCNH2）、隐睾病（GREAT）、血友病甲（F8C）、多发行硬化（MAG）等50多种疾病（候选基因）的变异筛选中。在肾脏疾病中，DHPLC也已被用于常染色体显性遗传的多囊肾相关基因PKD1和PKD2的突变筛选中[10]。此外，随着DHPLC功能被不断地开发拓展，目前除了用于基因变异的检测外，已被应用于DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定量、人种遗传学分析、基因作图、核酶中自身剪切反应的研究、CpG岛甲基化的分析、细菌鉴定[11]、DNA片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中；此外，DHPLC最近已被进一步应用到mRNA的检测中，例如，Gallo等建立方法对mRNA的可变剪接或转录产物的编辑进行了检测；Matin等将DHPLC与差异显示mRNA法（differentialmRNAdisplaymethod）的原理相结合，可用于鉴定差异表达的基因。在致病微生物检测领域，又显示出了广阔的应用前景，WilliamHurtle通过对不同谱系的39种细菌进行DHPLC检测，结果39种细菌中有36种的DHPLC谱图呈现特征峰型[12]。WilliamHurtle等又对炭疽杆菌的16s-23sRNA和gyrA基因进行分析，同样得到满意结果。随着应用研究的不断深入，和近来激光激发荧光检测技术的不断发展，使DHPLC法的检测灵敏度不断提高。随着与电喷雾电离质谱技术的联合应用，DHPLC技术正朝着不仅待测样品无需预先克隆扩增[13]，而且在发现突变的同时能够揭示突变的化学本质的方向高速发展。随着研究者对其认识的不断深入和提高，以及寻找更多疾病相关基因或用于连锁或进化分析的多态性标记的迫切需要，DHPLC这一高效、经济的检测技术在将来的基因组学研究领域中将继续发挥重要的作用。3.3基因芯片技术在寄生虫检测中的应用近几年新发展的基因芯片技术，由于基因芯片具有高通量和平行检测等特点，已经在基因组测序、基因表达及功能分析、基因文库筛选、基因突变检测及基因多态分析、新药物的筛选开发、病原体检测及致病机制研究等方面得到了广泛的应用。基因芯片是在基因组水平上发现并研究基因功能的有力工具。1996年Lockhart