重金属诱导长江华溪蟹RNA差异显示及定量分析

重金属诱导长江华溪蟹RNA差异显示及定量分析【摘要】：近年来,我国养殖业发展迅速,特别是虾蟹养殖已成为主导产业,在一些地区,已经成为增加农民收入的主要手段。因此,应当大力加强养殖过程质量管理与监控,严格控制水体污染,有效限制抗生素和其它化学药物的使用,尽量确保养殖水域的适养性和出塘产品的安全性,从生产源头上保证虾蟹产品的质量,实现无公害生产,以此推动我国水产养殖业的持续和健康发展。然而,经济的快速发展,工业污水、生活污水的超量排放,严重污染了养殖用水水源以及养殖自身的污染,也造成水质下降,环境恶化,病害日趋严重,发病面积逐步扩大,经济损失严重。例如,工农业和人类活动排放的大量含有重金属离子的污水对水域产生威胁。水污染的结果将导致虾蟹成活率降低和养殖成本提高,严重影响我国虾蟹养殖业的发展和水产品的出口创汇。因此,研究水环境中重金属(例如Cd、Cu)对经济虾蟹的影响,不但有助于深入了解和掌握重金属在生物体内的蓄积危害程度,从基因表达水平上阐明重金属协迫对渔业健康养殖的危害机理,而且对环境检测污染导致的生物体危害提供理论依据,同时对丰富甲壳动物毒理学的研究也具有重要意义。长江华溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)隶属于甲壳纲(Crustaceae).十足目(Decapoda)、溪蟹科(Potamidae)、华溪蟹属(Sinopotamon)。华溪蟹是我国淡水蟹类特有属的代表,种类最多,分布最广,数量也最大,见于整个长江水系及其支流等广阔地区的中高山区及丘陵、平原等不同的生态区。本研究以长江华溪蟹为实验材料,参照国家渔业水质标准,经不同浓度(5mg/L、0.5mg/L、0.05mg/L.0.005mg/LCd2+和0.1mg/LCu2+)镉、铜诱导24h、48h、96h,从分子水平研究在不同组织中积累的选择性与基因表达的差异性。一方面,用火焰原子吸收分光光度法测定Cd和Cu在组织中的积累。结果表明,镉、铜在体内的积累均具有组织特异性,积累量表现出明显的时间和剂量效应关系。积累量由大到小的顺序基本是：鳃肝胰腺心脏。在96h,Cd积累量达最大值,其中鳃为75±3.8μg/g,肝胰腺为70±2.9μg/g,但心脏中含量很少且在24h未检测到。Cu在未处理之前本底含量较高,鳃和肝胰腺中就达到20.8±1.2μg/g,而心脏中未检测到。Cd和Cu联合染毒后,Cu积累量与对照组相比变化不大,但是Cd的积累量与单独Cd处理比较积累量明显增加。在Cd5mg/L+Cu0.1mg/L染毒96h,Cd积累量在肝胰腺中高达121.3±3.1μg/g,鳃中101.2±3.4μg/g,心脏中8±0.9μg/g。另一方面,分别提取三种组织的RNA,用RT-PCR技术合成一链cDNA,采用锚定引物与20个随机引物之间组合的PCR反应,对染毒前后的mRNA表达差异进行研究,以寻找重金属应答基因。结果表明,锚定引物与20个随机引物之间组合进行PCR扩增差异条带较多,经筛选、再扩增并进行克隆测序验证其真实性,得到了应答基因的EST序列,提交序列到(?)GenBank中。首次获得了长江华溪蟹β-actin基因序列,并提交到GenBank中,登录号为GQ415418,同时对七种蟹进行了分子系统发育的初步分析。结果表明,长江华溪蟹和地蟹(Gecarcinuslateralis)、张口蟹(Neohelicegranulata)亲缘关系较远,锯缘青蟹(Scyllaserrata)和远海梭子蟹(Portunuspelagicus)亲缘关系很近,而中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)和远海梭子蟹(Portunuspelagicus)关系较远。用NJ法和ML法构建了分子系统树,得到了相同的拓扑结构。系统发育分析表明,长江华溪蟹单独形成一支,与其它海洋蟹的亲缘关系远,支持溪蟹单独划分为总科。随后,以SYBRGreenI为染料,β-actin为内参,检测样本荧光信号的域值循环数(Ct),用ComparativeDelta-deltaCt法对三种组织中金属硫蛋白(Metallothionein,MT)基因表达进行实时荧光定量分析,并用SPSS15.0统计分析。结果表明,随着Cd浓度升高,MT表达量也升高。MT表达在24h增加量较少,48h表达量急剧升高,且鳃和肝胰腺中增加量高于心脏组织的。Cd浓度5mg/L处理96h,肝胰腺MT基因表达最高增加到22.5倍,但0.05mg/L和0.005mg/LCd浓度组及对照组MT表达量变化不明显。在镉处理组中加入浓度为0.1mg/L的Cu后,当Cd浓度为5mg/L、0.5mg/L时,铜诱导鳃和心脏MT表达量急剧升高,促进效应明显。鳃MT基因表达量的最大值在5mg/L96h由12.5倍升高到18.36倍。而对于Cd浓度0.05mg/L和0.005mg/L,Cu的促进效应不明显。经重金属胁迫后,长江华溪蟹MT基因表达受时间影响不明显,但表现出明显的剂量效应关系,因而MT可作为监测镉污染的生物标识物。结论如下：1、长江华溪蟹组织中镉积累量表现出时间效应和剂量效应关系,联合染毒后Cd积累量明显增加。2、mRNA差异显示结果初步筛选并获得了一些重复性较好的差异条带,可能为镉应答基因。3、镉诱导长江华溪蟹MT基因表达出现清晰的剂量效应,Cu的存在能增强Cd的诱导MT基因的表达效果,两种金属表现出协同效应。4、长江华溪蟹可以做为一种检测镉污染的指示生物。【关键词】：长江华溪蟹RNA差异显示实时荧光定量指示生物重金属【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：S917.4;X174【目录】：摘要10-12ABSTRACT12-15第一章文献综述15-291基因表达差异研究进展15-221.1前言151.2基因表达差异的研究方法15-171.3基于PCR基因表达差异的研究技术17-201.4mRNA差异显示技术的应用20-211.5小结21-222重金属污染研究22-272.1重金属污染状况222.2镉的毒性及其机理22-232.3重金属对甲壳动物的影响23-252.4荧光定量PCR在胁迫诱导基因表达中的应用25-262.5研究展望26-273本论文研究的目的意义和研究方案27-293.1目的意义273.2研究方案27-29第二章长江华溪蟹组织器官RNA的提取29-361材料和方法29-311.1材料29-301.2长江华溪蟹组织RNA提取方法301.3除去总RNA中微量的DNA30-311.4RNA检测方法312结果31-342.1紫外光分光光度仪检测长江华溪蟹RNA的质量312.2长江华溪蟹RNA琼脂糖凝胶电泳31-332.3长江华溪蟹RNA电泳图的Genetools分析33-343讨论34-36第三章重金属诱导长江华溪蟹主要组织RNA的差异显示36-491材料和方法37-411.1材料371.2重金属积累样品的制备37-381.3长江华溪蟹组织RNA提取381.4组织RNA样品cDNA合成38-391.5重金属诱导长江华溪蟹的DD-PCR扩增39-401.6PCR产物凝胶电泳401.7PAGE凝胶银染法显色401.8差异片段的切取与再扩增40-411.9差异cDNA片段的克隆测序412结果与讨论41-492.1长江华溪蟹体内重金属的积累41-432.2重金属诱导长江华溪DD-PCR扩增43-462.3重金属诱导长江华溪蟹S23引物扩增的差异条带序列分析及同源性比较46-49第四章长江华溪蟹β-actin基因cDNA扩增及分子系统发育的初步分析49-581材料和方法50-511.1实验材料501.2组织RNA提取501.3cDNA合成501.4β-actin基因扩增及测序50-511.5数据分析512结果51-542.1凝胶电泳检测长江华溪蟹PCR产物512.2长江华溪蟹β-actin基因部分序列及七种蟹的同源序列分析51-532.3基于β-actin基因部分序列的分子系统发育树53-543讨论54-58第五章重金属诱导长江华溪蟹金属硫蛋白基因表达的定量分析58-85第一部分镉诱导长江华溪蟹金属硫蛋白cDNA的表达58-731前言58-602材料和方法60-622.1材料602.2长江华溪蟹组织消化60-612.3长江华溪蟹组织RNA提取与反转录PCR612.4长江华溪蟹MT基因实时荧光定量PCR61-622.5数据统计分析623结果62-683.1镉在长江华溪蟹主要组织中的积累62-633.2长江华溪蟹β-actin和MT基因RT-PCR63-643.3镉诱导长江华溪蟹MT基因在心脏中表达64-663.4镉诱导长江华溪蟹MT基因在鳃中表达66-673.5镉诱导长江华溪蟹MT基因在肝胰腺中表达67-683.6统计相关分析684讨论68-73第二部分镉与铜联合诱导长江华溪蟹MT基因的定量分析73-851前言74-752材料和方法75-782.1材料75-762.2长江华溪蟹组织RNA提取与纯化762.3长江华溪蟹组织样品的一链cDNA合成76-772.4长江华溪蟹组织样品的实时荧光定量PCR77-782.5数据统计分析783结果78-813.1长江华溪蟹β-actin基因序列测定78-793.2镉铜诱导长江华溪蟹心脏组织中MT基因实时荧光定量结果79-803.3镉铜诱导长江华溪蟹鳃组织中MT基因实时荧光定量结果80-814讨论81-85全文结论85-86参考文献86-96攻读学位期间取得的研究成果96-97致谢97-98个人简况及联系方式98-100本论文购买请联系页眉网站。