食品理化检验氨基酸及蛋白质.

第三章食品的营养成分分析水分的测定蛋白质和氨基酸的测定脂肪的测定碳水化合物的测定维生素的测定灰分及有关元素的测定第三节食品中蛋白质和氨基酸的测定DeterminationofproteinandaminoacidinFood复习一下1.蛋白质的元素组成C：50-55%H：6-8%O：20-23%N：15-18%S：0-4%微量元素：还含有微量的P、Cu、Fe、I等2.基本结构单位：氨基酸3.蛋白质的变性作用。（一）蛋白质的生理功能及在食品中的作用（二）食品中的蛋白质含量（三）蛋白质系数（四）蛋白质水解（五）蛋白质测定方法一、概述①蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分；②维持人体的酸碱平衡、水平衡；③物质的代谢及运转都与蛋白质有关;④蛋白质是食品的最重要的营养指标。其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。（一）蛋白质的生理功用及在食品中的作用不同食品蛋白质的含量不同，可作为质量检验的一种重要手段。(二)食品中的蛋白质含量谷类和面食：（%）大米（糙米、长粒、生）7.9大米（白米、长粒、生）7.1小麦粉（整粒）13.7玉米粉（整粒、黄色）6.9玉米淀粉0.3豆类：大豆（成熟的种子、生）36.5豆（腰子状、所有品种）23.6豆腐（生、普通）8.1水果和蔬菜：苹果（生、带皮）0.2芦笋（生）2.3草莓（生）0.6莴苣（冰、生）1.0肉、家禽、鱼：牛肉（颈肉、烤前腿）18.5牛肉（腌制、干牛肉）29.1鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生）23.1火腿（切片、普通的）17.6鸡蛋（生、全蛋）12.5鱼（太平洋鳕鱼、生）17.9鱼（罐装金枪鱼滴干的固体）26.5乳制品：牛乳（全脂、液体）3.3牛乳（脱脂、干）36.2干酪24.9酸奶（普通的、低脂）5.3不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同；一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。（三）蛋白质系数（四）蛋白质水解在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。蛋白质胨肽氨基酸利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法杜马斯法福林酚法染色法（五）蛋白质的测定方法凯氏定氮法1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱，在氢氧化钠的作用下，经水蒸气蒸馏使氨蒸出，用过量的硼酸溶液吸收后，再以盐酸或硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量，并换算成蛋白质含量。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定①消化2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2↑+12SO2+16H2O↑1加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点2加硫酸铜作为催化剂、消化终点指示剂3加氧化剂加速有机物氧化速度试剂的作用：详见教材P20（硫酸消化法）LOGO硫酸钾的作用作为增温剂，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，而加快有机物分解；一般纯硫酸的沸点在3400C左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3LOGO但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。LOGO硫酸铜的作用①催化剂2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。②可以指示消化终点的到达消化具体操作①准确称取样品，置于凯氏烧瓶中；②加入硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸摇匀；③置于电炉上，成45度角，小火加热。④待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液体变蓝绿色透明，再继续加热0.5～1h，⑤取下冷却后，小心加入水，转移至1000ml容量瓶，定容，作为样品液备用，同时做空白试验。②蒸馏按图安装好微量定氮蒸馏装置;于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基红指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶内加入硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O用硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定至灰色为终点指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲酚绿）指示剂红色绿色红色（酸）（碱）（酸）③吸收与滴定2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3计算X=1000W%100K)(CMVVN21•X为样品中蛋白质的含量•V1为样品消耗盐酸标准液的体积•V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积•C为盐酸标准液的浓度•MN为氮的摩尔质量•W为样品的质量•K为氮换算为蛋白质的系数半微量凯氏定氮蒸馏装置LOGO（1）测得的是粗蛋白含量（总氮量，含非蛋白氮）；（2）所用试剂应用无氨蒸馏水配制；（3）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。（4）若样品含脂肪或糖较多时，消化时易产生大量泡沫，可加少量辛醇或液体石蜡，或硅油消泡剂，并注意适当控制热源强度（要小火加热）。（5）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L2~3ml过氧化氢后再加热。注意事项LOGO（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。LOGO（7）蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（8）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。LOGO自动凯氏定氮仪特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化多个样品，消化时间短；（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。LOGO1、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？2、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？3、硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？作业氨基酸的测定DeterminationofaminoacidinFood氨基酸的测定方法氨基酸分析仪法（国标法）高效液相色谱法（HPLC)气相色谱法（GC)荧光分光光度法紫外-可见分光光度法氨基酸分析仪法1、原理利用氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。定量依据：是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。氨基酸自动分析仪氨基酸分析仪法2.操作方法（1）样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪等杂质后，直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。酸水解的方法：称取经干燥的蛋白质样品盐酸，置于110C烘箱内水解24小时，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样品上柱进行分析。氨基酸分析仪法如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法如下:去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物；去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物；去核酸：将样品在10%氯化钠溶液中，85℃加热6小时，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可；去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。氨基酸分析仪法（2）样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量视所用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸0.1mol左右(水解样品干重为0.3mg左右)；生成的紫色物质在570nm波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm波长下进行比色测定。（3）结果计算：根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类。从峰的高度和宽度可计算氨基酸的含量。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所得图谱如下：高效液相色谱法原理蛋白质样品经酸或碱水解后，将氨基酸进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中，采用高效液相色谱仪分离并用荧光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）又是HPLC仪的最常用配置。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。高效液相色谱法氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生：蛋白质经盐酸水解成游离氨基酸后，用邻-苯二甲醛和9-芴基甲氧基碳酰氯分别对一级氨基酸和二级氨基酸进行衍生化，再经过高效液相色谱反相C18柱分离后，再用紫外或荧光检测器检测。柱后衍生：蛋白质经盐酸水解成游离氨基酸后，经氨基酸分析专用柱，在流动相的梯度洗脱下，根据各种氨基酸的结构和性质的差别，将各种氨基酸分离开来，分离后的氨基酸再经过衍生化，用荧光检测器检测。高效液相色谱法柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸分析仪，如前文所提的茚三酮反应。在氨基酸的HPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：①固定相采用C18或其它疏水物，可分辨分子结构细小的差异；②反相洗脱，流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；③一机多用。