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食品生物复习重点基因工程:又称分子克隆或重组DNA技术,用酶学方法,将异源基因与载体DNA在体外进行重组,将形成的重组子DNA导入宿体细胞,使异源基因在宿体细胞中复制表达,从而达到改造生物品种或性状,大量生产出人类所需要的生物品种和产物。操作步骤:①采用酶切cDNA文库人工合成或PCR扩增，分离制取目的基因片段②采用核酸限制性内切酶Ⅱ同时剪切目的基因和克隆载体③在T4DNA连接酶的作用下将目的基因与载体基因连接而成重组DNA④把重组DNA分子导入受体细胞，并在一起扩增而成克隆子⑤标记分析和筛选出获得重组DNA分子的克隆受体细胞⑥进一步扩增、转化和表达，最终生成新的优良性状的菌种或人类所需要的产品。工具酶:在基因工程中应用的酶统称工具酶，是基因工程操作中不可缺少的工具。限制性内切酶:是一类专一性很强的核酸内切酶。它与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性及对磷酸二酯键的断裂方式有所不同，这些酶在基因分离、DNA结构分析、载体的改造及体外重组中均起着重要作用。种类:Ⅰ型酶:分子质量较大，是一类复杂的多功能酶，作用时需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸等辅助因子。能切割未修饰的DNA但切口识别序列特异性差。Ⅲ型酶：属双功能酶，有两种不同亚基，识别位点无规律，也许辅助因子。Ⅰ型酶与Ⅲ型酶在基因工程中应用价值低，Ⅱ型酶：分子质量较小，简单单功能酶，作用时无需辅助因子只需镁离子，能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，专一性强，识别序列与切割序列一致，适合于基因工程操作，其中E.coRI应用最广。限制酶的命名：以宿主微生物属名的头一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的三个字母的缩写。菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同一菌株中有不同的限制性内切酶时则一罗马数字区别。限制酶作用方式：机制：以环状和线形双链DNA为底物，在一定条件下识别一定的核苷酸序列，在两条链的特点硫酸二酯键上催化切开。作用方式及识别位点①识别不同特异核苷酸序列②识别序列皆具有回文结构③切割后形成各种黏性末端或平整末端④切割后形成异源二聚体。DNA连接酶：是外源目的基因片段与载体质粒DNA片段在体外连接形成重组DNA分子或称为杂合子。能催化DNA分子中相邻的3’-OH末端和5’-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键，即能封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口，常用：T4-DNA连接酶。DNA聚合酶Ⅰ：作用是催化聚合脱氧核苷酸，使之逐个接到引物上去，最后形成新的DNA。主要用来做DNA探针的体外标记，即缺口翻译，也用于酶法测定DNA顺序。碱性磷酸酯酶：催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5’-磷酸残键，即脱磷酸作用。在基因工程中主要是应用该酶处理经限制性核酸内切酶切割后的载体DNA，去除载体DNA两末端的5’-磷酸残键，以防止载体DNA自我环化，提高重组效率。T4多聚核核苷酸激酶：主要作为DNA5’-末端标记，标记待测DNA片段。S1核酸酶：对单链DNA或RNA具有特异性的核酸外切酶，产生5’-磷酰基的单核苷酸或寡核苷酸，但不能降解双链的DNA或RNA的杂合子。用来分析DNA-RNA杂合子结构。反向转录酶：能以RNA为模板反向转录后形成双链DNA。目的基因:（靶基因、外源基因）：按照人们预先设计的蓝图，获得所需要的特异基因。制取方法：1.生物学方法（①鸟枪射击法或滔弹散射法（适用于原核生物），快速简便、产物纯度高②分子杂交，根据碱基配对原理）2.化学合成法（以单核苷酸为原料，在体外按已知基因的碱顺序合成DNA片段，需先知核苷酸或氨基酸的序列）3.基因文库法（适用于真核生物，基因文库：用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。cDNA文库构建步骤：①酶促合成法制取cDNA②从组织或细胞中制备总RNA和mRNA③合成cDNA第一条链④cDNA第二条链的合成⑤双链cDNA与载体DNA的连接）4.PCR扩增法（PCR扩增法（聚合酶链式反应）：是一种用在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。步骤①使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链②在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合③在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定行进行聚合（延伸）反应④经过3个不同温度的重复循环，约经过30次后可增至10的六次方倍。）基因载体：目的基因的运载体，具有自我复制能力的质粒DNA，主要是质粒、病毒和噬菌体。应具备的条件①本身是一个复制子，能自我复制②相对分子质量小，小分子DNA易处理，限制内切酶切点少，适于接受目的基因③能给宿主细胞提供选择标记，有可供辨认的表型特征，以便人们进行筛选④只有单一限制性内切酶切点，经某一限制性内切酶切割后，既可以把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。质粒：存在于细胞、放线菌及酵母菌细胞内细胞质中双螺旋共价闭环的DNA。特性：①能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子②相对分子质量在1000-10000ku之间③成分和结构简单④含有染色体不存在的基因，负责编码某些功能。组建质粒载体pBR322：大小为4363pb含有2个抗生素抗性基因，即抗氨苄青霉素Ampr和抗四环素抗性基因(Tetr)作为标记。在四环素抗性基因有单一的BamHI、HindⅢ、SalI的识别位点，带有一个复制起始点。特性：①分子质量较小②拷贝数高③具有抗菌素抗性基因基因重组的方法：黏性末端连接法（直接黏接、加尾黏接）、平头连接法。宿主细胞：指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。必要条件：可接受DNA，为限制性内切酶缺陷型菌株或DNA重组菌株，其标记和载体相对应，利于表达，不适于人体或在非培养条件下生存，有利于安全。常见宿主细胞：以细菌为主，还有放线菌、酵母菌和哺乳动物细胞。其中微生物受体系统主要有大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌和酵母菌等。感受态：指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般宿主细胞在对数生长期转化能力最强。大肠杆菌感受态细胞的获得：即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌，以获得高效转化的感受态细胞。转基因微生物食品的应用①应用于提高食品产品的品质②应用于简化工艺，缩短生产周期③应用于食品的抗菌和防腐保鲜④应用于食品级酶制剂生产菌的改良⑤应用于生产保健食品的有效成分⑥应用于食品微生物快速检测。转基食品的转化方法：农杆菌介导转化法，PEG介导法，电激法，脂质体介导法，基因枪法。酶工程（酶技术）：酶的生产及其在生物反应器中进行催化应用技术过程。内容：酶的发酵生产与分离纯化、酶分子修饰、酶固定化技术、酶非水相催化以及酶应用。酶的制备：生物细胞内生物合成或直接提取分离获得、微生物发酵生产制取植物细胞培养产酶：首先从植物组织中选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得高产、稳定的植物细胞，然后用植物细胞在人工控制条件的植物细胞反应器中，如同微生物细胞，进行发酵而获得所需产物。优势：产率高，周期短，易于管理，劳动强度低，易于分离纯化。工艺流程：外植体￫细胞获取￫分离纯化￫产物。微生物发酵酶的优点：①种类繁多②微生物繁殖快、发酵周期短、产量高且培养基廉价，通过控制培养条件可大幅度提高酶的产量，便于实现大规模的工业化生产③微生物的适应性强，可通过诱导突变、基因工程、细胞融合等现代化生物技术选育出新的、更理想的微生物，从而得到人们需要的酶④同样的反应可利用来源于不同微生物的性质相近的酶催化，因此可灵活选择生物反应器，以便于前后工序相配合。常见的产酶微生物：细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），放线菌（链霉菌），霉菌（黑曲菌，米曲菌，红曲菌，青霉，木霉，根霉，毛霉），酵母菌（酿酒酵母，假丝酵母）。酶发酵生产细胞具备条件①安全可靠，是非致病菌，在系统发育上与病原体无关且不生产毒素，不影响环境，也不会对酶的应用产生其他不良影响②稳定性好，不易感染噬菌体，在通常条件下，能够稳定地用于生产不易退化③酶产量高，有较好的应用价值，高产细胞可以通过筛选、诱变或采用基因工程、细胞工程等技术而获得④容易培养和管理，要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制便于管理⑤能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。发酵产酶工艺条件以及控制：①培养基（碳源、氮源,无机盐,生长因子）②pH（1.不同细胞，其生产繁殖的最适pH值不同。一般细菌和放线菌最适pH值在中性至碱性范围，霉菌和酵母菌偏酸性2.发酵产酶的最适pH值和生长最适pH值往往不同。一般细胞产生某种酶的最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH3.通过控制培养基中的pH可改变细胞产生不同酶的产量比例4.随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH往往会发生变化，尤其当微生物产酸能力较强时，若不适当地加以调节，菌体就会被抑制甚至死亡。调节方法：采用改变培养基的组成或其比例，必要时可使用缓冲溶液，或添加适宜的酸、碱溶液，以调节培养基中pH的变化。）③温度④溶氧量⑤发酵时间控制。提高酶产量的措施①添加诱导物②控制阻遏物浓度③添加表面活性剂④添加产酶促进剂。表面活性剂分类：1.离子型（阳离子型、阴离子型和两性离子型，离子型表面活性剂（季铵型离子）对细胞有毒害作用，不用于酶的发酵生产）2.非离子型（用于增加酶产量，如吐温、特里顿等可积聚在细胞膜表面增加细胞的通透性（机理），有利于酶的分泌，所以可增加酶的产量。）端末代谢产物阻遏：指在生物生长发育过程中，原以一定速率合成某些酶，当这些酶催化生成的产物过量积累时，这些酶的合成受到阻遏，也称反馈阻遏。分解代谢产物阻遏：也称为葡萄糖效应，指有些酶，特别是参与分解代谢的酶，当细胞在容易被利用的碳源上生长时，其合成受到的阻遏。酶分子修饰：通过各种方法改变酶分子的结构，从而使酶的某些特性和功能发生改变的技术。意义：酶分子修饰技术对于酶学和酶工程的发展有着极其重要的作用，通过酶分子修饰技术，可以探索酶的结构与功能的关系，并可以提高酶活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性，改变酶的动力学特性等，从而提高酶在食品、医药、轻工、化工、环保和能源等领域的应用价值。方法：化学修饰：大分子结合修饰、肽链有限水解修饰、侧链基团修饰、分子内或分子间交联、氨基酸置换修饰、金属离子置换修饰，二、物理修饰。酶的非水相催化：酶在非水介质中进行的催化作用。水的作用：水分子对于维持酶的结构是必不可少的，酶活力构象的形成有赖于各种氢键、疏水键等非共价的相互作用，而水分子直接或间接参与氢键和疏水键的形成。因此水分子与酶分子的活性形成密切相关。酶只有在一定量水存在的条件下才能进行催化反应，但是只有与酶分子紧密结合的一层水分子对酶活力才至关重要，这层水叫必需水。常见有机介质反应体系：微水介质体系、反胶束体系（指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴）、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、与水不容性有机溶剂组成的两相或多项体系。有机介质中酶催化反应的条件及控制：1.酶的选择（看催化反应的速度大小，特别注意酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性和是否产生不同于水溶液中的酶促反应）2.含水量的控制（水活度在0.5-0.6之间）3.有机溶剂的选择4.底物的选择和浓度控制（根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择）5.pH的控制（通常与水溶液中催化的最适pH相同或相近）6.温度的控制（高于在水溶液中催化最适温度）酶的固定化：指将酶与不溶性载体结合，使游离酶、细胞或细胞器等的催化活动完全或基本上限制在一定的空间内的过程。意义：经过固定化的酶容易与溶液中的底物与产物分离，且可使酶反复使用、效率高，生产成本大大下降，并增强其稳定性。制备方法①吸附法（物理吸附法，离子吸附法）②包埋法（凝胶包埋法，半透膜包埋法）③共价键结合法（与载体共价键结合的酶功能基团：氨基,羧基,酚基,巯基,羟基,咪唑基,吲哚基）④交联法（共价交联四种形式：酶直接交联法,辅助蛋白交联,吸附交联法,载体交联法）。固定化酶的催化特性：①底物专一性（由于空间位阻的存在酶对高分子质量底物的活力减少）