食用菌菌种的制作与培养

食用菌菌种的制作与培养----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------一、母种制作（一）母种培养基制作1.母种培养基的种类母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种：（1）马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基马铃薯（去皮）200克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖）20克水1000毫升（2）麦芽汁—葡萄糖—琼脂培养基干麦芽250克琼脂15～20克葡萄糖（或蔗糖）10克水1000毫升（3）胡萝卜—葡萄糖—琼脂培养基胡萝卜100克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖）20克水1000毫升（4）蘑菇汁—葡萄糖一琼脂培养基（适用于蘑菇）鲜蘑菇250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖）20克水1000毫升（5）蛋白胨—葡萄糖—琼脂培养基蛋白胨2克葡萄糖20克磷酸氢二钾2克维生素B1（硫胺素）0.5毫克磷酸二氢钾0.5克琼脂18克硫酸镁0.5克水l000毫升2.母种培养基的制法以最常用的马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基的制法为例介绍如下：先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块加水1000毫升，煮沸15～20分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。试管口塞上大小合适的棉花塞，塞入试管口内的长度为棉塞总长的3/5。塞好棉塞后，每10支作一捆，用牛皮纸包扎好后，置铁丝网笼中，然后进行高压灭菌。如作为孢子分离用，则将培养基分装于三角瓶或培养皿中，然后高压灭菌。3.母种培养基的消毒灭菌：母种培养基通常用高压蒸汽灭菌锅来消毒灭菌，常用的高压蒸汽灭菌锅有直式、卧式和手提式三种。将配制好后的母种培养基移入上述任何一种高压蒸汽灭菌锅中，在15公斤/平方厘米压力下，灭菌30分钟。高压蒸汽灭菌主要是依靠提高蒸汽的温度来灭菌的，因此灭菌时，应将锅内的冷空气全部排除。否则，尽管压力表上的压力已达到要求，然而，灭菌锅内的温度却未达到所需的温度。排除冷空气的方法是加热后当压力表上指针上升到0.5公斤/平方厘米时，打开排气阀，放气至指针仍回到“零”的位置。灭菌的时间是以排除冷空气后，压力回升到1.5公斤/平方厘米时才开始计算。每次灭菌之后，要等压力降到“零”时，才打开锅盖，否则，灭菌的液体会因突然减压而外溢，玻璃器皿也会因突然降温而破裂。高压灭菌后将试管取出排成斜面备用。（二）母种分离材料的选择1.子实体的选择无论是用作孢子分离或组织分离的子实体，都要从产量高，长势好，适应性强，无杂菌虫害的群体中，选择朵大，生长健壮的单生子实体作为分离的材料。选作分离的子实体，成熟度要适当，如蘑菇、草菇具有菌膜，最好选菌膜将破而未破的成熟度，这种子实体发育已成熟，子实层又未受污染，因此能很快散出大量的无菌孢子。对没有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌，如香菇、平菇等，则以选取八分熟，正在释放孢子的个体为最好；因为刚从担子弹射出来的孢子基本上也是无菌的。2.菇木和耳本的选择木生食用菌如香菇、银耳、黑木耳等，可以从它们生长的基质，即菇木和耳木作为分离的材料。选择时，应从野生或人工栽培场所挑选子实体生长健壮，朵大，长势好，菌丝在段木中发育旺盛，材质较为结实，尚未腐烂，一般是接种后一年内已出菇、出耳而无杂菌害虫感染的幼龄菇木或耳木为最好。采去子实体后，截取适当部位，挂于通风处风干后，供分离时用。（三）母种的分离方法1.孢子分离法是利用食用菌的有性孢子或无性孢子，萌发成菌丝，获得细菌种的一种方法。按分离时挑取孢子的数目不同，又分为单孢子分离法和多孢子分离法两种。蘑菇、草菇等由于孢子没有性的区别，采用单孢子分离获得纯菌种，有结实能力，而其它食用菌如香菇、银耳、黑木耳等由于孢子有性别之分，单孢子分离得到的菌丝不能结实，所以，只在育种上采用，生产上很少采用多孢子分离法，是把许多孢子接种于同一培养基上，让它们萌发，自然交配而获得纯种。2.组织分离法是用食用菌幼嫩的组织块直接分离培养成纯菌种的方法。选用的子实体先经0.1％开汞水或70％酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。分离香菇时用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。3.基内菌丝分离法是利用食用菌生长的基质一菇木和耳木作为分离材料，而培养成纯菌种的方法。特别是银耳、黑木耳采用这种方法，成功率高，性状也较稳定，为生产上经常采用的方法。具体做法是从野生或人工栽培的场所，选择子实体发生早，生长旺盛，朵大，无病虫害的菇木或耳木，锯取一小段，让其充分风干后备用。分离时如为香菇的菇木，先锯取1厘米的薄片，切去四周用0.1％升汞水表面消毒1～2分钟，用无菌刀将其劈成小木片，再切成0.5平方厘米的小木条，移入试管斜面培养基上，经25～27℃培养，菌丝生长后，再行转管培养。分离时如为银耳的耳木，先从长有子实体部位，锯取1～2厘米厚的木片，剔除树皮及耳基，再用0.1％升汞水或75％酒精涂擦表面消毒，通过耳基着生处，把耳木纵切为二，用无菌刀在耳基着生处，削取极小的木屑，移入试管斜面培养基上。接种后放在20～28℃的温度下培养，数天后接种块的周围开始长出纤细的白色菌丝，延伸到培养基后，培养基的颜色逐渐变黄转黑，表面出现浅灰色斑纹，这就是羽毛状菌丝。一星期后，小木屑上出现白色短绒毛状菌丝，同时分泌白色或淡黄色水珠，这就是银耳的发育菌丝。挑取银耳发育菌丝和少许羽毛状菌丝转接于新的斜面培养基上进行扩接，一星期后，菌丝长满试管，即成为母种。在实际分离中往往不可能得到银耳菌丝与羽毛状菌丝两者兼有的母种。或纯为银耳菌丝；或纯为羽毛状菌丝；或酵母状分生孢子，还有相当数量是感染杂菌或不长任何菌丝的。纯银耳菌丝和纯羽毛状菌丝，经适当配合后，就可应用于生产。黑木耳的耳木分离，其操作方法与银耳大致相同，但不象银耳有多种类型的菌丝。耳木接入试管后，一般放在22～28℃培养2～3天，可见菌丝长出。选生长健壮、清楚、两端展整齐的，进行转管纯化2～3次培育成母种。在培养过程中，有时培养基背面会出现乳白色或淡褐色，这是正常现象。（四）母种的扩大培养从分离获得或外地引入的优良母种，由于数量有限不能满足生产上的需要，应进行扩大繁殖培养。其方法是以无菌操作把斜面培养基连同菌丝体切成短米粒大的小块，移接到新的斜面培养基上，在适温条件下培养，待菌丝长满斜面时即成。一般每支母种试管可扩大繁殖60～80支新管。扩大母种第一次应多些，以避免多次转管，造成菌丝生活力降低，结菇（耳）少，影响产量和质量。一般要求转管不要超过五次。二、原种的制作（一）原种常用培养基1.原种培养基的种类（1）木屑-米糠培养基（适用于各种食用菌）木屑78%、米糠或麸皮20%、白糖1%、石膏1%、水适量。（2）木屑培养基（适用于木耳、香菇）木屑98%、葡萄糖1%、尿素0.3%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.2%、高锰酸钾0.05%、碳酸钙0.4%、水适量。（3）棉籽壳培养基（适用于多种食用菌，如平菇、猴头）棉籽壳100%、水适量。（4）棉籽壳-木屑培养基（适用于木耳、香菇、银耳、金针菇、灵芝、猴头等）棉籽壳70%、木屑28%、糖1%、石膏1%，水适量。（5）棉籽壳-麸皮培养基（适用于多种食用菌）棉籽壳80%、麸皮18%、糖1%、石膏1%，水适量。（6）玉米芯-麸皮（米糠）培养基（适用于平菇、木耳、猴头等）玉米芯78%、麸皮（米糠）20%、过磷酸钙1%、石膏1%，水适量。（7）稻草（麦麸）-麸皮培养基（适用于平菇、草菇、凤尾菇等）干稻草（麦草）78%、麸皮20%、过磷酸钙1%、石膏1%、水适量。（8）草粪培养基（适用于双孢蘑菇、草菇等）稻草或麦麸20ｋｇ，粪肥（干）30ｋｇ水适量。现将草、粪、石膏混合均匀，加适量水发酵好后，取稻草或麦秸切成２ｃｍ的长度，调整水分，装瓶灭菌。（9）麦粒种培养基（适用于平菇、猴头、白灵菇、杏鲍菇、金针菇等）小麦1000ｇ、白糖10ｇ、石膏10ｇ。先将小麦浸泡4ｈ，加热煮沸20～30ｍｉｎ，煮时加白糖，煮至麦粒熟而不开花，过滤后，摊开晾晒。不粘手时拌入石膏粉，即可装瓶灭菌。（二）原种培养基的制作方法首先结合当地原料情况，选适宜的培养料。根据上述配方，凡加糖的，应先将糖溶于水中，其余原料混合均匀后，用糖水拌料。拌均匀后，培养料的含水量用手测，即手握培养料，指缝间有水渗出，但不滴为宜（料的含水量达60％～70％）。含草粪的培养料，最好经发酵出处理，料的ｐｈ调为6.5～8.然后把培养料装入已洗净的菌种瓶、罐头瓶或制菌种用的塑料袋内，装的松紧适度，上下一致。装料高度以齐瓶肩为宜。装好后，即可装锅灭菌。灭菌时由于培养基体积较大，数量较多，瓶壁又厚，故灭菌时间要适当延长，在0.15MPa的压力下灭1.5～2ｈ，可达到灭菌目的。也可用常压灭菌锅进行灭菌8～10ｈ，达到灭菌效果。三、栽培种的制作栽培种培养基配方的配制，制作方法与灭菌方法与原种培养基相同。但最好不用麦粒种，因栽培用量大。另外用常压灭菌锅进行灭菌，也不易灭彻底。做栽培种培养基所用的容器可采用制种用的低压聚乙烯或聚丙烯塑料袋（简称菌种袋），也可以采用瓶装。但在生产上多采用菌种袋，袋的大小一般为15～18cm×30～35cm。装培养料时，尽量装得松紧适度，四周紧中间松，装入量占袋子2/3为宜。袋口可用塑料圈，也可用绳子直接扎住，但不要扎的过紧，以防灭菌时爆袋。四、食用菌接种与培养技术（一）、食用菌的接种技术接种是食用菌制种工作中的一项最基本的操作，无论是食用菌的传代，分离、鉴定还是进行食用菌的形态、生理等方面的研究都离不开接种操作。接种的关键是严格无菌操作，根据不同的目的、不同的菌类及同一菌类的不同菌种容器，接种方法都有所区别，但在无菌条件进行严格的无菌操作这一点是必须共同遵守的。１.无菌操作规程（１）接种前对接种箱（室）进行清洁消毒，准备好接种工具。将待接的母种培养基或原种培养基或栽培种培养基放入接种箱内或室内，用药物熏蒸消毒，有条件也可用紫外线灯、净化设备消毒灭菌；（２）换好清洁的工作衣，取少许药棉，蘸上75%的酒精擦拭双手，菌种容器表面，工作台面及接种工具；（３）点然酒精灯开始接种操作。酒精灯火焰周围8cm半径范围的空间为无菌区，接种操作必须在无菌区内进行。２.接种方法（１）母种接种按上述要求做好无菌操作准备后，进行接种。ａ．用75%酒精棉球涂擦工作人员的手和菌种试管外壁进行消毒，放入接种箱或接种室内；ｂ．用酒精棉涂擦接种针，再在酒精灯上烧红；ｃ．左手排握着菌种和斜面试管，右手握持接种针，用中指与无名指、无名指与小指；分别把菌种和斜面培养基上的试管棉塞拔开；ｄ．用接种钩伸入菌种管割取菌种，不宜过大，米粒大小，迅速转接入斜面培养基中央；将试管口在酒精灯火焰上灼烧一下；塞好试管棉塞；ｅ．接上菌种的斜面试管贴上标签，注明菌名和接种日期等。整个转管过程应在酒精灯火焰8-10c㎡范围的无菌区进行。转接后的试管，放入适宜的温度下培养至长满斜面。（２）原种接种要求做好无菌操作准备后，进行接种。a.