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细胞HE染色法实验一、原理苏木素(Hematoxylin)-伊红(Eosin)染色法，简称HE染色法。HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。该染色过程既有化学反应，又有物理作用参与。从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。从物理现象看，主要有吸附、吸收之说。HE染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法二、实验用品固定液：常用95%乙醇和冰丙酮苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%盐酸。系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。三、实验步骤样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。样品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。染核：苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。吹干或自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片。若细胞用4%多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。细胞转染48h后，制备单细胞悬液，细胞爬片，完全培养基培养6小时待细胞贴壁后，更换无血清培养基继续培养4-12h，然后进行HE染色。HE染色步骤：1.取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。2.样品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。3.染核：苏木素染液染色1min，自来水洗涤3min，温水返蓝5min。4.染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤3min。吹干或自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片。正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：一、自噬诱导剂(1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：模拟内质网应激(2)Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶）(3)Earle's平衡盐溶液：制造饥饿(4)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：ClassIPI3KPathway抑制剂(5)Rapamycin：mTOR抑制剂(6)XestosponginB/C：IP3R阻滞剂二、自噬抑制剂(1)3-Methyladenine（3-MA）：（ClassIIIPI3K）hVps34抑制剂(2)BafilomycinA1：质子泵抑制剂(3)Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomallumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。三、自噬过程进行观察和检测细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：1、观察自噬体的形成由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagicvacuole，AV）2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。3、利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。6、CellTrackerTMGreen染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。四、自噬相关蛋白的定位在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔