饮用水单一毒性快速检测方法--作品(论文)

1饮用水单一毒性快速检测方法学院：资源与材料学院作者：冯茹伍艳馨郝晓霞李敏闫凯丽刘梅杰张承基摘要：本文主要利用淡水发光菌-青海弧菌q67检测CdCl2、HgCl2、K2Cr2O7的单一毒性以及联合毒性，探究在安全范围内的饮用水评价标准，根据数据通过线性回归分析后计算EC50值，对比不同重金属化合物对青海弧菌的影响。关键词：发光菌；饮用水；快速检测；重金属化学物中图分类号：X131.2文献标识码：A1引言随着工业和科学技术的不断发展，饮用水的安全性也受到了一定的影响。现今，由于各种饮用水污染事故的频发，使得人们对饮用水的安全更加重视，相关领域专家对其进行了一系列的研究。因为发光菌具有灵敏度高、检测快速的优点，被广泛应用于重金属化合物的急性毒性检测中。本文利用青海弧菌检测汞、镉、铬的单一毒性，比较不同重金属对发光菌的抑制程度以及时间对发光菌的影响。其中将汞作为标准毒物。2发光菌简介2.1发光菌在毒性检测中的作用原理发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响判断毒物毒性的大小。发光细菌含有荧光素荧光酶等发光要素在有氧条件下通过细胞内生化反应会产生微弱荧光。当细胞活性升高处于积极分裂状态时其含量高发光强度增强，发光细菌在毒物作用下细胞活性下降，含量水平下降导致发光细菌发光强降低。实验显示毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。2.2发光菌应用现状近年来水污染问题日益严重，成为严重威胁人类生命健康成为世界性的环境治理难题。科学研究工作者已开发出许多灵敏有效的环境监测方法这些方法可以划分为两类：分析技术和生物监测。分析技术常常用于废水常规指标的测试但不能反应水质综合毒性的大小。传统的生物监测以水蚤藻类或鱼类为受试对象虽然能反映毒物对生物的直接影响。但是这些方法的最大缺点是实验周期长实验过程比较繁琐。针对传统生物毒性检测方法的不足，作为一种新型的生物监测技术发光细菌法表现出了以下四个突出的特点：2（1）灵敏、快速且容易进行（2）发光菌容易培养（3）可以用来检测污染物有无致癌作用（4）青海弧菌仅需要达到生理盐水（0.85%的盐度）的渗透压环境即可。除此之外，它不仅能测定单因子指标还能快速准确测出环境的综合毒性指标具有理化法无可比拟的优势因此发光细菌法近年来受到了环境工作者的广泛关注。3实验材料与方法3.1实验仪器与试剂3.1.1实验仪器（1）BHP9511水质毒性快速检测仪北京滨松光子技术有限公司（2）移液枪DragonLaboratoryInstrumentsLimited（3）BT223S型电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司3.1.2实验试剂3.2实验材料（1）模拟配制不同浓度梯度的重金属溶液通过查阅文献，找到合适的浓度范围，通过预实验，设置一组合适的单一毒性的浓度梯度。（2）菌种的选取由北京滨松光子技术有限公司提供的青海弧菌（Vibrioqinghaien-sissp.nov.）Q67小种作为实验菌种。试剂名称等级厂家Hgcl2分析纯（AR）天津科密欧化学试剂有限公司K2Cr2O7分析纯（AR）天津科密欧化学试剂有限公司CdCl2·H2O分析纯（AR）天津科密欧化学试剂有限公司复苏液北京滨松光子技术有限公司渗透压调节液北京滨松光子技术有限公司33.3实验方法3.3.1发光菌的工作条件及复苏实验室温度控制在20~25℃范围，同一批样品在测定过程中温度波动不超过±1℃，且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置于控温的实验室内。取一支青海弧菌Q67小种冻干粉安培瓶，在20℃室温下平衡15min，加入0.5ml复苏液，手持安培瓶振荡，充分混匀菌液，20℃室温下平衡15min。3.3.2单一毒性EC50的测定取2mL测试管，每个浓度点设两个平行，每个平行含2支样品管和2支空白对照管，将测试管放好，依次加入2mL复苏稀释液和重金属样品溶液（经渗透压调节液调节后）。用10-100错误!未找到引用源。L的移液枪准确吸取50错误!未找到引用源。L复苏菌液，逐一加入各管，轻轻振荡。每管在加菌液的当时精确计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间，每管加菌液间隔时间控制在5s，自加菌液时间起15min后，将测试管放入生物毒性测试仪内，测定发光量。3.4数据处理及评价方法发光菌的相对发光强度和发光抑制率都可以作为毒性表征参数，二者的计算公式分别表达如下：相对发光强度（%）=错误!未找到引用源。%100对照发光强度样品发光强度发光抑制率（%）=1－相对发光强度其中，相对发光强度数值越大，样品的毒性越小，而发光抑制率数值越大，样品的毒性越大。本文研究用青海弧菌Q67小种与样品作用15min时的相对发光度作为毒性表征参数。使用发光抑制率等于50%时样品的浓度值EC50来表达，EC50是指能引起50%最大效应的浓度。EC50越小，相应的重金属毒性越大。通过比较不同重金属的EC50来衡量各重金属对发光菌的毒性大小。4不同重金属对发光菌的毒性作用4.1选用的剂量-效应拟合函数一般来说，剂量-效应数据的建模是基于没有随机性和误差的假设，效应可以通过确定的函数关系由浓度预测出来。根据试验值与拟合值之间的相关系数R2选择最优回归模型。R2越接近1，模型的预测能力越强。4通过多种曲线的拟合试验，本文选用最优回归模型（Slogistic1）对剂量-效应曲线进行拟合。模型参数中，XC表示曲线对原点的相对位置，XC越大整个剂量-效应曲线水平位移越大。a值描述曲线的斜率，a值的大小与重金属离子的毒性在不同浓度范围内的变化趋势成负相关，也即与剂量-效应曲线的陡度成负相关关系，当a增大时，曲线陡度变缓。表4.1本文选用的述“S”型曲线的函数经典化学中特别是分析化学中广泛应用最小二乘拟合技术来描述分析物浓度与响应信号间的关系。在本文研究中，对重金属发光菌的生物毒性检测结果的评价与预测，同样采用的是非线性最小二乘拟合技术对剂量-效应曲线进行拟合。具体做法为：以不同剂量对发光菌的发光抑制率作图，横轴表示重金属溶液的浓度，纵轴表示测得的发光菌的发光抑制率，然后用非线性最小二乘技术进行拟合。非线性最小二乘方法的编程实现对于普通实验室尚有困难，但是我们可以应用Origin软件的非线性最小二乘拟合工具实现对剂量-效应曲线的拟合。通过对各个重金属的剂量-效应数据进行非线性拟合操作，得到参数a、K、XC、R2以及一条“S”型曲线，由此可以计算出各重金属对发光菌的EC50值。4.2Hg2+对发光菌的剂量—效应曲线单因子试验得出一系列梯度浓度的相对发光抑制率，取稳定性最好的一组。通过剂量-效应曲线所得Hg对发光菌的剂量-效应关系如图所示。表4.2Hg对发光菌的剂量-效应分析溶液质量浓度/(mg·l-1)00.060.080.10.120.140.160.18Hg抑制发光度020.330.539.965.486.29497.1曲线回归分析y=97.1/(1+exp(-47.63346*(x-0.09694)))R2=0.9863函数类型解析式Slogistic1y=a/(1+exp(-k*(X-XC)))5Hg对发光菌的剂量-效应曲线图4.2Hg对发光菌影响由上式算得Hg的EC50值为0.104mg/L.从中可知，XC表示曲线对原点的相对位置，XC为0.09654，曲线偏离Y轴的水平位移较大。a值为97.1，说明剂量-效应曲线的陡度较大，即其毒性随浓度的增加变化较快，通过上图曲线可看出Cd2+发光抑制度随浓度的增加上升先是较快，后变慢，最终趋于平缓，符合S型曲线的规律。表明低浓度的Cd2+溶液对青海弧菌的毒性效应较明显，即青海弧菌对低浓度的Cd2+不敏感，随着浓度增大，敏感度增强。有前人的研究可以推测，用不同的发光菌菌种做受试种时，不同的重金属离子的差异性不同。4.3Cd2+对发光菌的毒性作用在实验中，我们以CdCl2为提供试验用Cd2+的实验试剂，按实验前设计的一系列浓度梯度配置好相应浓度溶液，设定两组对照组，将样品放于BHP9511水质毒性快速检测仪中，并向其中依次加入已复苏的青海湖菌Q67适量，待一段时间后，开始检测发光菌发光强度变化，从而反映重金属离子对发光菌的抑制度。经过查阅相关文献，我们初步确定Cd2+对发光菌的毒性作用实验，Cd2+浓度梯度（mg/L）分别为0.1,0.15，0.25,0.35，0.45,0.55,0.65,0.75,0.85,1，2，4，7，10。经过相应预实验及实验数据分析，我们重新确定实验用浓度（mg/L）梯度范围分别为0.15,0.25,0.35，0.45,0.55,0.65,0.75,0.85。单因子试验得出一系列梯度浓度的相对发光抑制率，取稳定性最好的一组。应用Slogistic1模型对剂量-效应曲线进行拟合，所得Cd2+对发光菌的剂量-效应关系如图所示。表4.3Cd2+对发光菌的剂量-效应分析溶液质量浓度/(mg·L-1)0.150.250.350.450.550.650.750.856Cd抑制发光度1.615.732.245.358.166.573.174.4曲线回归分析y=74.7335/(1+exp(-9.208*(x-0.3999)))R2=0，9931Cd对发光菌的剂量-效应分析0.00.20.40.60.81.0020406080Inhibition(%)Concentration(mg/L)DataFittedbySlogistic1Cd2+图4.3Cd2+对发光菌的剂量—效应曲线由式计算可得Cd2+对发光菌的半数效应浓度即EC50值为0.476mg/L。从中可知，XC表示曲线对原点的相对位置，XC为0.3999，曲线偏离Y轴的水平位移较大。a值为74.7335，说明剂量-效应曲线的陡度较大，即其毒性随浓度的增加变化较快，通过上图曲线可看出Cd2+发光抑制度随浓度的增加上升先是较快，后变慢，最终趋于平缓，符合S型曲线的规律。表明低浓度的Cd2+溶液对青海弧菌的毒性效应较明显，即青海弧菌对低浓度的Cd2+不敏感，随着浓度增大，敏感度增强。有前人的研究可以推测，用不同的发光菌菌种做受试种时，不同的重金属离子的差异性不同。4.4Cr2+对发光菌的毒性作用试验方法与Cd2+类似，在实验中，我们以K2Cr2O7为提供试验用Cr2+的实验试剂，按实验前设计的一系列浓度梯度配置好相应浓度溶液，设定两组对照组，将样品放于BHP9511水质毒性快速检测仪中，并向其中依次加入已复苏的青海湖菌Q67适量，待一段时间后，开始检测发光菌发光强度变化，从而反映重金属离子对发光菌的抑制度。经过查阅相关文献，我们初步确定Cr2+对发光菌的毒性作用实验，Cr2+浓度梯度（mg/L）分别为0.1,0.5，1，2，3.5，7.5，10。单因子试验得出一系列梯度浓度的相对发光抑制率，取稳定性最好的一组。应用7Slogistic1模型对剂量-效应曲线进行拟合，所得Cd2+对发光菌的剂量-效应分析如图所示。Cr对发光菌的剂量-效应分析图4.4Cr对发光菌的影响表4.4Cr6+对发光菌的剂量-效应分析由式计算可得Cr6+对发光菌的半数效应浓度即EC50值为1.167mg/L。从中可知，XC表示曲线对原点的相对位置，XC为0.58013，曲线偏离Y轴的水平位移较大。a值为99.4，说明剂量-效应曲线的陡度较大，即其毒性随浓度的增加变化较快，通过上图曲线可看出Cr2+发光抑制度随浓度的增加上升较快，最终趋于平缓，符合S型曲线的规律。表明青海弧菌对于低浓度的Cr2+即较为敏感。4.5时间对发光菌的影响-以汞为例表4.5.17min数据溶液质量浓度/(mg·L-1)00.5123.57.510Cr抑制发光度038.786.39297.999.499.2曲线回归分析y=99.4/(1+exp(-1.54391*(x-0.58013))）溶液质量浓度mg/l00.060.080.10.120.160.18抑制度011.723.740.56285.4回归方程y=94/(1+exp(-43