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摘要多酚氧化酶是植物中常见的生物催化剂，常催化植物中的各种生物化学反应。若以马铃薯为原料提取多酚氧化酶进行分离纯化等研究则需要使用乙醇作为提取剂。通过研究得到马铃薯多酚氧化酶的理化性质，酶作用的最适温度和pH分别是40℃和pH5.8。为了了解低浓度下的亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏重亚硫酸氢钠、抗坏血酸、半胱氨酸以及谷胱甘肽等试剂对马铃薯多酚氧化酶的影响，将上述试剂按一定浓度加入马铃薯多酚氧化酶中进行试验，结果表明这些试剂都对多酚氧化酶有一定的抑制作用。关键词:马铃薯多酚氧化酶抑制作用StudyonthefeatureofthePotatosPolyphenolOxidaseLiBozhi（CollegeofLifeSciences,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,510642,China）Abstract:Polyphenoloxidaseisacommonbiologicalcatalystinplants.AlwaystakepartinmanycatalyticreactionofplantsBiochemicalreaction.Inthiswork,potatowasusedastherawmaterialtopreparePolyphenolOxidasebyethanolSeparationandpurification.TostudiedthephysicalandchemicalpropertiesofPotatosPolyphenolOxidase.WeLearntthatthebesttemperatureandPHforthisenzymeis40℃andpH5.8。InordertoknowCys,Glutathione,Vc,SodiumBisulfite,SodiumsulfiteandSodiumsulfitethesereagent’sactionforthePotatosPolyphenolOxidase.WeaddthesereagentsatacertainconcentrationinPotatosPolyphenolOxidase.Theresultsshowedthatthesereagentshadacertaininhibitoryeffectonpolyphenoloxidase.Keywords:PhtatoPolyphenolOxidaseinhibition目录1前言··································11.1多酚氧化酶研究情况··························11.1.1多酚氧化酶结构与特性························41.1.2多酚氧化酶结的定位·························41.1.3多酚氧化酶在酚类物质中的作用····················21.1.4多酚氧化酶与褐变··························21.2马铃薯以及产业概况··························31.3马铃薯多酚氧化酶的研究意义与研究内容·················32多酚氧化酶的提取纯化··························32.1试剂与仪器······························32.2方法·································42.2.1马铃薯多酚氧化酶提取与纯化·····················42.2.2酶活性测定·····························53结果··································53.1马铃薯多酚氧化酶的纯化研究······················53.1.1低浓度下亚硫酸氢钠对多酚氧化酶催化反应的影响············53.1.2亚硫酸钠对多酚氧化酶催化反应的影响·················63.1.3低浓度下抗坏血酸对多酚氧化酶催化反应的影响·············73.1.4低浓度下谷胱甘肽对多酚氧化酶催化反应的影响·············83.1.5低浓度下半胱氨酸对多酚氧化酶催化反应的影响·············93.1.6低浓度下焦亚硫酸氢钠对多酚氧化酶催化反应的影响··········104讨论·································11参考文献································14致谢·········································································································1511前言1.1多酚氧化酶研究情况1.1.1多酚氧化酶结构与特性多酚氧化酶(PolyphenolOxidase简称PPO)是一类广泛分布于植物体中的一种铜结合酶。它是由核基因编码、多基因控制,在细胞质中合成,通过一定的方式转运至质体内而成为具酶活性的形式,对农产品品质形成有重要影响（代丽等，2007）。PPO是由核基因编码，多个基因控制，表现出多基因的家族性。在番茄中有7个编码PPO的核基因(PPOA、A′、B、C、D、E、F)；在马铃薯中，编码PPO的核基因至少有6个，分别为POT32、POT33、POT41、PT72、NOR333、P1、P2；蚕豆、苹果中至少有四个基因编码PPO；对小麦的PPO进行QTLs定位分析表明，小麦的PPO至少由3个不同的基因编码，控制PPO活性的主效基因位于2D染色体上，2A、2B、3B、3D和6B染色体上有一些微效基因等等（代丽,等2007）。具有导肽进入叶绿体的蛋白是要通过翻译后加工，初始合成的前体要比成熟的蛋白长，导肽是负责细胞器外膜的初始识别，对细胞器蛋白的定位有重要意义。现有研究也证明PPO分子由无活性转变为有活性的过程中需要经历肽链加工。（代丽,等2007）。具有保守序列对植物PPO基因的研究过程中无一例外的发现：所研究的植物均含有保守序列-编码铜结合部位的功能区域（代丽,等2007）。不存在内含子长期以来对植物PPO基因的研究，认为PPO基因是无内含子的，如马铃薯、葡萄、杏、番茄等，然而Paul等在研究香蕉时，在香蕉果肉中找到一个含85bp内含子的PPO基因，其内含子富含AT(85%)，并有保守的5'供体(donor)和3'受体(acceptor)的剪切位点，符合内含子5′GT...AG3'原则。（代丽,等2007）。1.1.2多酚氧化酶结的定位为了弄清多酚氧化酶的生理功能,必须首先考虑它的细胞和组织定位.不同组织具有不同的功能,而这些组织的功能是靠构成组织的细胞共同完成的,细胞的功能又是由细胞内各种各样的细胞器及众多酶类共同作用来实现.（黄明，等1998）对多酚氧化酶的细胞定位研究(包括分级分离研究、细胞化学研究和免疫细胞化学研究等)表明多酚氧化酶是一种质体酶,缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶,例如筛管和筛胞等.但是,有些具有质体的组织细胞也可能没有多酚氧化酶活性,例如在C42植物叶中,只在叶肉组中探测到多酚氧化酶活性,维管束鞘细胞尽管含有丰富叶绿体,却检测不到多酚氧化酶活性.总之,多酚氧化酶存在于含有质体的植物组织,而含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶.（黄明，等1998）1.1.3多酚氧化酶在酚类物质中的作用多酚氧化酶在酚类的物质代谢中的作用主要体现在含有质体和液泡内容物的混合液环境中,具体说来就是衰老和受伤的情况.在衰老方面,常用多酚氧化酶来解释黑橄榄及其它暗褐色、黑色且常常是死的植物组织的色素的发育.因为褐变是由已存在的底物与酶的接触引起,所以,在能分离的多酚氧化酶活性与衰老之间有时不相关联.在衰老过程中能分离的多酚氧化酶活性的增加是由于原已合成的酶的激活所致.可见,多酚氧化酶在此过程中的生理意义不大.然而,由于受伤而出现醌类物质的快速产生却具有明显的生理意义,无论是机损伤还是病虫害引起的细胞破裂,通过多酚氧化酶与酚类物质相互作用而产生的醌类物质性质很活泼,质体的破坏导致多酚氧化酶的激活与从液泡中释放出来的酚类物质起反应(酶和底物的区域分布界限被打破),产生醌类物质,参与保护植物免受进一步伤害.多酚氧化酶是一种相对较稳定的酶,尽管其反应产物对酶有一定的抑制作用,多酚氧化酶的活性仍可维持较长时间,导致醌类物质的不断产生.（黄明，等1998）1.1.4多酚氧化酶与褐变新鲜果蔬在加工贮藏等过程中会发生的酶促褐变,主要就是由于果蔬中所含有的多酚氧化酶的作用。在高等植物体中绝大多数情况是这样：多酚氧化酶定位于叶绿体的类囊体和其它质体的基质中，而它的酚类底物在液泡中，因此正常组织中的正常情况下它们是空间隔离的，当植物组织受损，这种空间隔离被打破，多酚氧化酶与底物接触，发生作用，羟化单酚为双酚，二酚酶活性氧化双酚为醌，醌自发集合且和细胞内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐色物质，从而导致组织酶促褐变。加工过程中因物理损伤等原因而导致这种情况是很普遍的。不仅如此，果蔬贮藏时因为失水、低温等原因，运输时因为碰撞等原因，都会使果皮等细胞中的空间隔离被打破，在氧的参与下就会发生褐变。例如马铃薯的黑斑损伤产生就是因为在收获或处理中导致生理紊乱，由多酚氧化酶氧化自身的酚类底物所致。褐变不但会降低产品的感官、味道，而且因为醌类物质会与蛋白质的一些侧链基团(如-SH，-NH2)结合使蛋白质的结构，营养特征发生改变而降低营养价值（王浩，3等2006）。酶促褐变需要三个条件，它们是酶、底物和受氢体氧。控制三个条件中的任意一个因素或几个因素便能够达到控制果蔬酶促褐变发生的目的。在加工等生产实践中，底物和氧一般不容易除去。在这种情况下抑制导致酶促褐变的多酚氧化酶的活性成为加工过程中控制酶促褐变的极其重要的方法（王浩，等2006）。1.2马铃薯以及产业概况马铃薯是一种重要的高产经济作物，全世界有2/3以上的国家都种植马铃薯，产量达30亿吨左右，是仅次于小麦、玉米、水稻而居第四位的粮食作物。马铃薯营养丰富，素有“地下苹果”和“第二面包”之称，早已为许多国家和人民所重视。美国农业部研究中心的341号研究报告指出:“作为食品，全脂奶粉和马铃薯两样便可以提供人体所需的一切营养素”，并且认为马铃薯将是世界粮食市场的一种主要食品。我国是世界马铃薯主产国之一。常年种植面积约409万hm2,产量约600.45亿吨,居世界首位。但是马铃薯的加工利用却相当落后，马铃薯贮藏过程中，由于腐烂、发芽引起的损失占原料的30%。由多酚氧化酶引起的酶促褐变以及美拉德反应引起的非酶褐变损害了产品的感官性质，产生变色、变味等不良影响（陈芳,等2002）。因此，对于马铃薯以及其他果蔬，研究防止褐变是非常重要的。在马铃薯中导致褐变的关键酶就是多酚氧化酶。1.3马铃薯多酚氧化酶的研究意义与研究内容多酚氧化酶与果蔬褐变，黑色素生成等有密切的关系，故研究多酚氧化酶具有广泛的意义和实际应用价值。例如，多酚氧化酶与黑色素合成有关，研究它对于化妆品开放很有帮助。在保鲜技术研究方面，研究多酚氧化酶意义重大。马铃薯在贮藏和加工的过程中发生的褐变现象是一个急需解决的大问题。褐变造成的感官，营养等降低，使得产品滞销，造成大量经济损失（张丽香，2015）。本论文从提取纯化多酚氧化酶出发，在研究多酚氧化酶基本性质的基础上，对一些物质进行抑制剂研究。对马铃薯等果蔬的保鲜具有指导意义。2多酚氧化酶的提取纯化42.1试剂与仪器实验材料与试剂：无水乙醇，考马斯亮蓝G-250，邻苯二酚，十二水合磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，3，5-二硝基水杨酸，葡萄糖，氢氧化钠，盐酸，酒石酸钾，重蒸酚，亚硫酸钠，牛血清蛋白，磷酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，琼脂，三羟甲基氨基甲烷，十二烷基硫酸钠，巯基乙醇，溴酚兰，甘油