钉螺非特异性免疫因子溶菌酶研究进展

钉螺非特异性免疫因子溶菌酶研究进展朱秀安，黄汉韬，杜康，汪安云，赵劲松*1[摘要]溶菌酶普遍存在于自然界的动物、植物、微生物体内，在动物体可作为一种天然的抗感染物质，是生物体内重要的非特异性免疫因子之一。本综述总结了近年来溶菌酶的分类、溶菌酶基因结构及功能、表达规律和影响溶菌酶活性的因素，为进一步探讨其在钉螺体内分布和细胞定位提供知识背景。[关键词]溶菌酶；钉螺；基因；表达；活性；定位Researchprogressonthenon-specificimm-unefactorslysozymeofOncomelaniaZHUXiu-an,HUANGHan-tao,DUKang,WANGAn-yun,ZHAOJing-song**Correspondingauthor[Abstract]Thelysozymegenerallyexistsinanimals,plantsandmicroorganisms,whichcanbeusedasanaturalanti-infectionmaterialandisoneoftheimportantnon-specificimmunefactorsinorganisms.Thesummarysumsuptheclassification,theexpressionregulation,thegenestructureandthefunctionoflysozymeandthefactorsthataffectingtheactivityoflysozymeandlysozymeorientationintheOncomelaniaofrecentyears,inordertofurtherdiscussthelysozyme’sdistributionintheOncomelaniaandcellularlocalizationprovidingbackgroundknowledge.[Keywords]lysozyme;Oncomelania;gene;expression;activity;location*通讯作者：赵劲松，副教授，皖南医学院基础医学院课题：溶菌酶在钉螺消化系统和生殖系统的细胞定位.2015年大学生科研基金项目.(校级).溶菌酶在钉螺消化系统和生殖系统的细胞定位.2015年省级优秀青年人才基金项目.溶菌酶在钉螺消化系统和生殖系统的细胞定位.2015年国家级大学生创新创业训练计划基金项目.钉螺，隶属于腹足纲，钉螺属，是日本血吸虫唯一的中间宿主。钉螺体内有多种抗菌物质，如：凝集素；溶菌酶；抗菌肽等。溶菌酶，早在1922年Fleming[1]等在鸡蛋清、鸟蛋、人的鼻涕、唾液及眼泪等发现溶菌因子并命名为溶菌酶(lysozyme)。它是一种很有效的抗菌物质，全名为1，4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酸水解酶。在1965年，DavidPhillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构[2]。溶菌酶的本质就是蛋白质，其抑菌机制是破坏细菌的细胞壁，同时具有不易产生抗药性，代谢快，活性稳定的特性。1溶菌酶的分类根据溶菌酶生物来源可以将溶菌酶分为6类：3种动物型溶菌酶，即C型(chieken—lysozymetype)、G型(goose—type)和I型(invertebrate—type)；植物溶菌酶(plant—type)；T4噬菌体溶菌酶(phage—type)；微生物溶菌酶(bacteria—type)[3]。溶菌酶在动物体内有C、G、I三型，但在脊椎动物中广泛存在C、G型，无脊椎动物中有C、G、I三型[4]。其中C型、G型、I型是研究最广泛、最透彻的溶菌酶。G型溶菌酶最初在鹅蛋清中被鉴定出来而得名，分型为OHLysG1，OHLysG2，OHLysG3，这三型是腹足类软体动物钉螺的表达序列标签[5]；从鸡蛋清中提取的C型溶菌酶HEWL(Heneggwhitelysozyme)是溶菌酶的原型，其分型有C-1,C-2,C-3三型，多拷贝C型基因存在于奥利亚罗非鱼等鱼类[6]。2溶菌酶的基因结构及功能C型成熟溶菌酶的基因编码130个氨基酸残基[7]。G型溶菌酶基因外显子数量多变，如鱼类G型溶菌酶基因有5个外显子，人类有7个外显子，鸡和其他哺乳动物的G型溶菌酶有6个外显子；文昌鱼的C型溶菌酶和脊椎动物的类似，都含有4个外显子[8]。亚洲石斑鱼C型溶菌酶基因组序列从转录起始点到转录终止点由1491个碱基对组成，包括4个外显子和3个内含子，而G型溶菌酶基因的DNA序列由1232个碱基对组成，包括5个外显子和4个内含子[9]。软体动物鲍鱼G型溶菌酶基因组有7个外显子和6个内含子[10]，C型溶菌酶基因组有6个外显子和5个内含子[11]，而i型溶菌酶基因组有4个外显子[12]。i型溶菌酶基因的外显子和内含子数量因物种不同而改变，冈比亚按蚊和冰岛扇贝有4个外显子，贻贝有5个外显子[8]。杨西建等人[13]因海参i型溶菌酶与失稳酶在结构上具有相似性，因此推测其同样具有异构肽活性，能水解纤维蛋白，在无脊椎动物免疫系统和消化系统中溶菌酶起到非常重要的作用。溶菌酶作为日本沼虾的非特异性免疫因子，其可作为沼虾亚急性中毒的检测指标[14]。研究分析表明，果蝇酸性溶菌酶是成蝇唾液腺分泌进入肠道的消化酶，可能具有免疫防御功能[15]；同样半滑舌鳎的G型溶菌酶有防御细菌感染的作用[16]；海鲈鱼的G型溶菌酶具有水解细菌细胞壁的功能[17]。在软体动物体内，溶菌酶不仅能水解细菌细胞壁，还可诱导调节其他免疫因子的合成及分泌[18]。由此可推测溶菌酶在钉螺体内不仅有抵制清除外来致病微生物的功能，而且还具有水解纤维蛋白的功能。3溶菌酶基因的表达C型溶菌酶基因在动物多种组织和细胞中表达，主要有3种表达模式[19]：(1)作为非特异性免疫的主要成员之一，C型溶菌酶主要在动物的免疫组织和细胞中表达，这一点在昆虫中尤为突出；(2)C型溶菌酶在某些食草类动物、昆虫和海洋生物的消化系统中高度表达；(3)C型溶菌酶在某些脊椎动物(小鼠和斑马鱼)的巨噬细胞中表达，被当作骨髓细胞系发育的分子标志。C型溶菌酶基因在细胞中的表达是在细菌内毒素(Lps)刺激巨噬细胞使其分化上调至最大水平时发生的[20]。四种互补编码多肽和C型溶菌酶被鉴定在瓢虫体内转录相似并被暂命名为C-1,C-2,C-3,C-4[21]。郑清梅[22]等研究溶菌酶基因在水生动物体内的表达显示，C型溶菌酶在日本牙鲆肾脏、脾脏、脑和卵巢等组织中有明显转录。G型溶菌酶基因的复制曾被发现在一些脊椎动物，包括哺乳动物，斑马鱼和鸡体内进行，这里DavidMIrwin[23]表明，G型溶菌酶基因的复制在脊椎动物普遍存在，但除去软骨鱼类。如G型溶菌酶基因在鲑鱼的头肾处有较高水平的转录[24]。JianfengDing[25]等人发现菲律宾蛤仔噬菌体基因(RplysPh)在血细胞中的转录水平比其他受试组织高。在软体动物中溶菌酶广泛存在于许多组织器官，尤其是产卵器官，消化腺，足丝腺，和外套膜分泌液中[18]。而G型溶菌酶在日本牙鲆的多种组织均有表达[22]。李新新[26]等人根据毕赤酵母密码子与LYZL4的高亲和性，克隆出人类C型溶菌酶基因LYZL4，并表明重组的LYZL4蛋白具有明显溶菌活性。C型溶菌酶在亚洲石斑鱼的肝脏中高水平表达，而G型溶菌酶在肠道中高水平表达[9]。I型溶菌酶在鲍鱼的肝胰腺中表达水平高，在消化道内表达水平低[12]。G型溶菌酶的3种分型在钉螺肝胰腺中高水平表达，并且OHLysG1,OHLysG2,OHLysG3的mRNA水平在肝胰腺表达较头足肌肉和肠高。在阳性钉螺中，3种G型溶菌酶基因表达被大幅上调，在肝胰腺中达最大，而肠中最低[5]。钉螺体内酚氧化酶(PO)大致位于肝脏及可能进行血淋巴输送至靥表面及外套膜[27]。LDH(乳酸脱氢酶)分布广泛，SDH(琥珀酸脱氢酶)主要分布在神经核心部分，生殖腺睾丸，输精管等，G-6-Pase(葡萄糖-6-磷酸酶)主要分布于卵巢和胃壁、肝腺管，Mg++—ATPase(三磷酸腺苷酶)主要分布于汗腺管颗粒细胞层、胃壁、卵巢等，ALP(碱性磷酸酶)主要分布于消化系汗腺管壁、胃肠壁、头足部上皮表膜，ACP(酸性磷酸酶)主要分布于肝腺管颗粒细胞、胃壁上皮细胞和睾丸，CHE(胆碱酯酶)主要分布于头足部上皮、汗腺管内壁、鳃管呼吸上皮等处[28]。而溶菌酶定位的文献尚未见报道。4影响溶菌酶活力的因素4.1溶菌酶活力的定义在37℃条件下，一定浓度的混浊菌液因溶菌酶水解细菌细胞壁肽聚糖使细菌裂解而浓度降低，透光度增强，故根据透光度变化来计算溶菌酶含量，从而得出溶菌酶活力[29]。4.2温度和pH值通过检查溶菌酶的抑菌作用，溶菌酶活力在温度达到50℃之前随着温度的升高而升高，之后随着温度的升高而降低；溶菌酶活力在pH达到7.0之前随着pH值的上升而上升，之后随着pH值的上升而降低[30]。所以，溶菌酶活力最适温度为50℃，最适pH为7.0。4.3螺龄和季节通过对溶菌酶活力的测定，得出成螺的溶菌酶活力高于幼螺。湖北钉螺体内溶菌酶的活力会随季节的变化而变化，冬季秋季夏季春季。其原因可能是不同季节执行免疫功能的因子不同，或是不同季节病原微生物优势种群的变化影响到钉螺免疫因子的变化[30-31]。5小结本综述主要介绍了溶菌酶的基因表达，以深化人们对溶菌酶的认识，着重介绍了C型溶菌酶基因在瓢虫和日本牙鲆及水生动物中的表达，G型溶菌酶基因在钉螺头足部和腹部的表达，和I型溶菌酶基因在无脊椎动物肝胰腺的表达，及其它酶在钉螺体内的大致定位，如酚氧化酶、LDH、SDH、ACP、ALP、CHE、，G-6-Pase、Mg++—ATPase等。溶菌酶作为一种天然蛋白质，研究文献较多，但仅局限于部分生物，尤其在钉螺体内的研究更少，未见溶菌酶、凝集素和抗菌肽在钉螺体内的细胞定位研究。目前日本血吸虫病仍未完全消灭，作为非特异性免疫成员的溶菌酶，在自体免疫中发挥着重要作用，故对钉螺体内溶菌酶的理化性质、分布、基因表达和影响因素等的研究仍是热点科研问题。本课题组目前正在开展溶菌酶细胞定位相关研究，从而为深入研究溶菌酶参与自体免疫机制提供基础资料。[参考文献][1]FlemingA.Onaremarkablebacteriolyticelementfoundintissueandsecretions.ProceedingsoftheRoyalSocietyB:BiologicalSciences,1922,93:306-317.[2]方元超,梅丛笑,尹宁.溶菌酶的应用前景[J].中国食品添加剂,1999,(4):39-43.[3]Callewaert,L;Michiels,C.W.LysozymesintheanimalKingdom[J].Biosci,2010,35:127-160.[4]NaXu,JunliPan,ShoushengLiuetal.Threeinone:Iden-tification,expressionandenzymaticactivityoflys-ozymeinamphioxus[J].DevelopmentalandComparativeImmunology,2014,46:508-517.[5]ShuH.Zhang,DanD.Zhu,MingX.Changetal.Threegoose-typelysozymeinthegastropodOncomelaniahupensis:cDNAsequencesandlyticactivityofrecombinantpro-teins[J].DevelopmentalandComparativeImmunology,2012,36:241-246.[6]禹绍国,叶星,张莉莉等.奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析[J].农业生物技术学报,2010,18(1):66-74.[7]SamaR,BottR.Crytallographics