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第二十章免疫检验自动化仪器分析1．了解免疫检测自动化的基本概念2．了解免疫检测自动化设计的基本原理3．了解免疫检测自动化仪器在临床上的应用4．掌握常用的几种免疫检测自动化仪器的检测原理、应用以及评价，本章重点免疫检验自动化(automationofimmunoassays)是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。第一节自动化免疫浊度分析系统免疫浊度分析属液相沉淀试验，其基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。一、免疫透射比浊法【原理】一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱(图9-7)，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。二、免疫胶乳比浊法原理用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。三、免疫散射比浊法【原理】粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：式中Iθ为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度；N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离；θ为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4颗粒直径1/10λRayleigh散射1/10λ颗粒直径≤λDebye散射颗粒直径≥λMile散射㈠定时散射比浊法（fixedtimenephelometry）定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。㈡速率散射比浊法（ratenephelometry）速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的速度（不是免疫复合物累积的量），连续测定各单位时间内复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1min～2min即可完成。表抗原抗体复合物形成的速率累计时间（s）形成IC总量速率累计时间（s）形成IC总量速率58－1013515251220603525150903023080353007040360604541555504504555480306050020抗原抗体反应速率的动态变化BNProSpec全自动特定蛋白分析仪BNP防抗原过量的设计：优化反应条件，令初始稀释度分析范围更宽，保证抗原抗体反应呈最佳比例预反应程序：IgM，LamU，AlbU，β2MUVLinIntegral计算程序定时散射比浊法测定原理示意图IMMAGE全自动特定蛋白分析仪一、特异性二、比例性三、可逆性一、抗体来源：兔，羊，---二、亲合力三、浓度四、电解质，(增浊剂)五、pH六、温度抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的影响因素抗体抗体的质量特异性强，效价高，亲和力强，R型抗体的含量抗体过量抗体的特异性抗体只针对相应的抗原，非特异性的交叉反应会引起伪浊度。抗体的效价一个合格的比浊用抗体其效价必须在1：20（抗体稀释度）以上，否则易形成伪浊度。抗体的亲和力亲和力强则抗体活性高，不仅可以加快抗原抗体反应速度，而且形成的免疫复合物较牢固，不易发生解离。R型抗血清以家兔为代表的小动物血清，如豚鼠、大白鼠、家兔、家禽、羊等动物的免疫血清。这类抗血清亲和力高，与抗原结合后不易再解离，抗体过剩时易形成大而稳定的复合物，抗原过剩时则形成可溶性复合物。H型抗血清以马为代表的大动物血清，如驴、骡、马等动物的免疫血清。该血清亲和力弱，抗原抗体结合后极易再解离，抗原过剩和抗体过剩皆易形成可溶性复合物。pH：6.5~8.5离子强度：在一定范围内，离子强度大，IC形成快；离子强度过低或无电解质存在，则不易出现可见的沉淀反应。3.增浊剂的使用为了提高抗原抗体复合物的形成速度，常常要加入增浊剂，如分子量为6000～8000的3%～4%聚乙二醇（PEG）或吐温-20（tween-20），以消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原抗体结合。但PEG浓度过高，分子量过大会引起血清中其他蛋白质（如IgM、α2巨球蛋白、脂蛋白）非特异性沉淀，形成伪浊度。因此，使用恰当的增浊剂，合适的浓度是准确测定所必须的。4.伪浊度非抗原抗体特异性结合形成的浊度，称为伪浊度，可导致抗原检测结果假性升高。伪浊度形成的原因包括①混浊标本、高血脂标本、反复冻融标本；②抗体效价低（1:20）、抗血清灭活处理、抗血清含有交叉反应性抗体等；③增浊剂PEG浓度过高；④抗血清细菌污染和变质；⑤器材尤其是比色杯不清洁、尘埃污染等；⑥缓冲液的离子强度太高，pH和温度不适合等，都对浊度产生影响。5.标准曲线制备与质量控制应用仪器规定的标准品制备剂量-反应曲线，一般采用5点或6点定标，然后选择适当的数学方法进行曲线拟合；每更换一批试剂，应重新制备剂量-反应曲线。为保证结果准确可靠，选取合适的质控血清，每次开机进行室内质量控制是极其必要的。根据全自动酶联免疫分析系统的处理模式，人们通常将全自动酶免分析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由“前处理系统”即全自动样本处理工作站和“后处理系统”即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。自动化酶联免疫分析系统全自动酶免分析仪可对6～30块板酶标板同时进行工作，具有一套完整的工作和分析系统，不同的仪器大小不同、配置不同，但性能基本相同。1.条形码识别系统2.样本架和加样系统3.试剂架4.温育系统5.液路系统6.洗板系统7.酶标板读数仪8.自动装载传递系统9.计算机管理和信息系统仪器评价全自动酶免分析仪中的连体机是将样本处理工作站和全自动酶免分析仪联合起来，工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本的处理，如血站系统。分体机，由于它有一个独立的全自动样本处理站，加样速度快，适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。自动化免疫比浊分析仪，全自动化学发光免疫测定系统，全自动化学发光酶免疫测定系统，全自动电化学发光免疫测定系统，自动化酶联免疫测定系统等。本章重点谢谢