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牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定一、实验目的1、学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理，熟悉紫外分光光度计的使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和能力很强，分散性高，在乳中呈高分子状态。本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。2、紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理：大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，通过测定在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理：考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白：烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚2、紫外光吸收法：紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考马斯亮蓝法：紫外可见光分光光度计、试管1.5cm×15cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白（0.1mg/ml）、考马斯亮蓝、0.9%NaCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将20mLpH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃2、将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液4、待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心5min，弃上清，得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次，3000rpm离心5min，弃上清6、在沉淀中加入20mL95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次（10ml/次），最后用乙醚洗涤沉淀2次（10ml/次），抽干8、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品9、准确称量，计算含量和得率紫外光吸收法1．取待测样品溶液置于的石英比色皿中，于分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280nm和A260nm，用生理盐水为比色空白对照。2．若A280nm/A260nm1.5，用公式：蛋白质含量（mg/ml）=A280nm/6.3*10若A280nm/A260nm1.5，用公式：蛋白质含量（mg/ml）=1.45A280nm—0.74A260nm考马斯亮蓝法取9支干净试管，按表进行编号并加入试剂。混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（μg/ml）作为横坐标作图得标准曲线。五、实验数据酪蛋白质量：0.5421g酪蛋白含量：2.71g/100ml牛乳紫外光吸收法：A280nm0.769AA260nm0.959AA280nm/A260nm1.5，蛋白质含量（mg/ml）=1.45A280nm—0.74A260nm=0.405mg/ml考马斯亮蓝法管号1（空白）23456789标准蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.8——样品/ml———————110.9%NaCl/ml10.90.80.70.60.40.200考马斯亮蓝染液/ml4.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度/（μg/ml）0102030406080A595nm00.1400.2880.430.5760.6550.9720.1780.262蛋白质浓度为