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雌二醇荧光偏振免疫分析方法试验方案1.雌二醇半抗原的合成方法：将150mg(0.55mmol)E2（258.36g/mol）溶于3mL干燥的二甲基亚砜中,加入0.5g(9mmol)KOH粉末。搅拌5min后加入150mg(1.07mmol)溴乙酸。继续搅拌,反应2h后加入25mL冰水。乙酸乙脂萃取回收未反应的E2。水相用2mol/LHCL酸化,出现白色沉淀。砂芯漏斗过滤,沉淀物用蒸馏水洗至中性,放入烘箱干燥，得白色沉淀（记录质量）。点板监控，用乙酸乙酯：石油醚=3：2（加1滴冰乙酸）的展开剂比例。从结构上可以看到有一个羧基暴露，所以可以考虑将荧光素衍生出一个氨基，使其两者可以结合。2.对荧光素进行衍生2．1中间产物异硫氰酸荧光素乙二胺fluoresceinthiocarbamylethylenediamine(EDF)的合成反应式见图：图.EDF合成过程Figure.ThesynthesisofEDF具体步骤：（1）配制甲醇三乙胺溶液，三乙胺浓度为10mL/L。（2）将20mg（0.3mmol）(70ul)乙二胺和11.7mg（0.03mmol）FITC，分别溶于5mL甲醇三乙胺溶液和1mL甲醇三乙胺溶液中。（3）将FITC溶液逐滴(约每30秒一滴)加到三乙胺溶液中，室温(室温产率很低，请尝试40度水浴或油浴)避光搅拌反应，刚投料后TLC监控一次（用稀FITC溶液作对照，以后每次都是），随后每隔30minTLC监测一次，直至FITC点消失。（4）旋转蒸发浓缩反应液（旋干！！之后在烘箱烘30min！！非常重要），用展开剂乙酸乙酯:甲醇＝3:1展开，观察有新物质产生。（5）装一个短而粗的层析柱，用纯的乙酸乙酯冲洗50mL，换成乙酸乙酯:甲醇＝3:1冲洗，待下边黄色FITC带下来后，用甲醇冲洗柱子，收集滤液浓缩即得纯化EDF，得到粉末状的EDF；或者不用甲醇冲，直接色谱柱最上层红黄色带刮下来，放入离心管用甲醇震荡冲洗，离心收集上清，反复冲洗离心3-5次，合并上清。2．2中间产物异硫氰酸荧光素己二胺fluoresceinthiocarbamylhexylenediamine(HDF)的合成反应式见图：图.HDF合成过程Figure.ThesynthesisofHDF具体步骤：（1）配制甲醇三乙胺溶液，三乙胺浓度为10mL/L。（2）将？mg（0.033mmol）己二胺和11.7mg（0.03mmol）FITC，分别溶于5mL和1mL上述甲醇三乙胺溶液中。（6）将FITC溶液逐滴(约每30秒一滴)加到三乙胺溶液中，室温(室温产率很低，请尝试50度水浴或油浴)避光搅拌反应，刚投料后TLC监控一次（用稀FITC溶液作对照，以后每次都是），随后每隔30minTLC监测一次，直至FITC点消失。（7）旋转蒸发浓缩反应液（旋干！！之后在烘箱烘30min！！非常重要），用展开剂乙酸乙酯:甲醇＝3:1展开，观察有无新物质产生，是否还有FITC存在；若无，则不用进行下步。（8）若仍有FITC存在，则装一个短而粗的层析柱，用纯的乙酸乙酯冲洗50mL，换成乙酸乙酯:甲醇＝3:1冲洗，待下边黄色FITC带下来后，用甲醇冲洗柱子，收集滤液浓缩即得纯化EDF，得到粉末状的EDF；或者不用甲醇冲，直接色谱柱最上层红黄色带刮下来，放入离心管用甲醇震荡冲洗，离心收集上清，反复冲洗离心3-5次，合并上清。8.527.654.853.荧光标记物的合成（活泼脂法）具体步骤：（1）将(40μmol)需标记的半抗原,？15.3mg(80μmol)EDC（MW=191.7）和9.7mg(80μmol)NHS(115.09)溶于400μL的DMF中，室温下搅拌反应过夜。（2）次日，将反应产物离心去除沉淀，得到活化反应产物。（3）将上述溶液中加入5.05mg(10μmol)HDF，室温下避光搅拌反应过夜。（4）反应液的一小部分(大约50µL)用硅胶60GF254TLC板分离，展开剂（氯仿：甲醇：甲酸=4：1：0.1）。（5）分别刮下最上边的两条黄色带，分别用1mL甲醇提取，得到的黄绿色液体分别收集置于4℃下保存2.示踪物活性鉴定这里具体问王强的做法。一般是先做tracer的倍比系列稀释，测其荧光值，在稀释曲线的拐点处偏上一点的浓度作为工作浓度将初步确定稀释度的示踪物50µL加入到50µL的系列稀释抗体(1/100、1/200、……、1/409600)中，每孔50+50µL，静置5分钟后，以WallacVICTOR31420多标记分析仪测量其FP值。如果是有活性的带则会表现出FP值有显著的升高，并且随着抗体稀释倍数的增大而降低，一般情况下，抗体稀释100倍与409600倍会有将近100以上的变化。3.示踪物浓度的估测与稀释曲线绘制已知摩尔消光系数ε＝8.78×104M-1·cm-1，得到有活性的带后测定示踪物在492nm下的吸光值(A)，根据以下公式估算：Ctracer=AεL做法于活性鉴定的方法相同，只是示踪物的浓度准确定为1nM，根据得到的稀释曲线计算出70%结合时的抗体稀释倍数，待后面研究动力学时用。4.克百威标准溶液的配制标准品用甲醇配置成初始浓度为20mg/mL，然后用甲醇分别稀释为20ng/mL,200ng/mL,2000ng/mL,1×104ng/mL,2×104ng/mL,1×105ng/mL,2×105ng/mL,2×106ng/mL,1×107ng/mL。实验过程中用BB溶液稀释20倍对应得到浓度范围为1ng/mL,……,1×106ng/mL,5×106ng/mL共9个梯度度。5.竞争FPIA将100µL的示踪物与20µL药物先后加入酶标板孔中，再加入100µL克百威单抗，上机测FP值。以药物浓度的对数值为横轴，FP值为纵轴作标准曲线。6.标准曲线的拟合应用originPro7.5软件中的四参数方程模块拟合竞争标准曲线。以FP为纵坐标，以标准品浓度的对数为横坐标，建立回归曲线。四参数方程为：Y=A-D[1+(x/C)B]+D其中Y为FP，A和D分别代表药物浓度最大和最小时的FP，也称为曲线的上下平台。C为中点浓度，当药物浓度等于C时的FP为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子，一般认为无明确的生理学含义。以IC10为检测限，以IC20-IC80为检测范围。7.动力学研究将100µL的示踪物(浓度约1nM)与20µL药物终浓度为10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的克百威标准品先分别加入酶标板孔中，再加入克百威单抗，选择70%结合时的抗血清稀释度为抗血清工作浓度（根据前面试验得到的抗体稀释曲线确定），上机检测连续读数测FP值。选择FP值不再变化的时间点作为检测时间。注：加抗体时一定要同时加入，并且最好要作三个平行。8.示踪物浓度的确定固定抗体稀释倍数，选择tracer浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，3.0nM，药物浓度为0.1，1，10，50，100，500，1000，10000，50000，100000ng/mL作标准曲线，比较δmP、IC50及δmP/IC50，选择使检测灵敏度较高的示踪物浓度为工作浓度。注：三种示踪物全部作δmP：表示药物浓度最大与药物浓度为零时FP值的差值。9.最佳抗体稀释倍数的确定用选定的示踪物浓度，作抗体稀释曲线，选择70%结合时的抗体稀释度为抗血清工作浓度。10最佳示踪物选择通过比较由三种示踪物得到标准曲线的IC50值、LOD、δmP和检测范围等参数，来确定最优的示踪物。Tracer抗血清效价δmPrangebIC50(ng/ml)LODa(ng/ml)检测范围12311.基于一种示踪物的FPIA方法的建立（这部分详细内容自己查一下资料看有没有人作过，主要用哪几种交叉反应药，添加回收试验怎么做）11.1精密度多次平行实验，计算批间与批内变异系数。11.2准确度通过回收率实验，计算变异系数，评估基质效应。11.3交叉反应率通过计算结构类似物与抗体的交叉反应率，从而验证方法的特异性。*草胺半抗原的合成与鉴定搅拌状态下将170mg*草胺、62mg3-MPA、0.11gKOH依次加入10mL乙醇中，回流4h，过滤，减压脱溶得*草胺半抗原（BMPA）粗品，用8mL5%的NaHCO3溶解粗品，然后用6mol/L的HCl调pH至3.0，乙酸乙酯萃取（5mL×3），合并有机相，水洗（20mL×3），有机相用无水Na2SO4干燥，在20×20cm的薄板上薄层层析（展开剂苯:1，4-二氧六环:冰乙酸=90:10:1），将Rf=0.52处物质刮下，乙醇提取，减压脱溶，即得BMPA纯品，收率约为68%。纯化后的BMPA采用氢核磁共振（1HNMR）、电喷雾质谱（ESI-MS）、红外光谱（IR）确证结构。人工抗原合成按照石敏丙草胺的方法。