雌激素污染对水体微生物产甲烷功能的影响

1雌激素污染对水体微生物产甲烷功能的影响赵颖1，阮爱东1,#，刘忱潇1，谢显传2（1.河海大学水文水资源与水利工程科学国家重点实验室，中国，南京，210098；2.南京大学水科学研究中心，中国，南京，210093）摘要：针对目前水体环境雌激素的污染形势严峻，且其对水体功能性微生物群落影响规律及机理不明等问题，选择典型天然雌激素——17β-雌二醇(E2)为主要研究对象，构建实验室厌氧水体微生态系统，分析E2污染对厌氧水体微生物活性和产甲烷功能的影响规律。结果表明，在厌氧条件下，E2污染对水体微生物群体的活性存在显著的抑制效应，对水体甲烷的产生速率亦存在规律性的影响。当水体E2浓度≤0.5ng/L时，对水体微生物的产甲烷活性存在促进作用。当E2浓度≥1.0ng/L时，E2污染对水体微生物的产甲烷活性存在明显的抑制效应，且随着E2浓度的升高抑制作用增强。因此，厌氧条件下，微量E2污染会影响水体微生物活性和产甲烷效应的变化，从而对水体自净功能和甲烷释放产生影响。关键词：17β-雌二醇；产甲烷菌；厌氧微生物活性；产甲烷功能ImpactoftraceestrogenscontaminationontheanaerobicmicrobialandmethanogenicactivityYingZhao1，AidongRuan1，#，ChenxiaoLiu1，XianchuanXie2(1.Statekeylaboratoryofhydrology-waterresourcesandhydraulicengineering,HohaiUniversity,Nanjing,P.R.China;2.CenterforHydrosciencesResearch,NanjingUniversity,Nanjing,P.R.China)Abstract:Theenvironmentalestrogenspollutioninaqueoussystemsisseriouslyinrecentyears.基金项目：国家自然科学基金面上项目（No.51378175）作者简介：赵颖（1988-），女，硕士研究生，研究方向为环境微生物学，（电子邮件）[e-mail]；#通讯作者：阮爱东，副研究员，博士，研究方向为环境微生物学，（电话）025-83786014，（电子邮件）[e-mail]2Andtheunderlyingmechanismonhowtheyaffectthefunctionalmicroorganismgroupsinwaterbodyhasnotbeenknown.Inthisstudy,thetypicalestrogen——17β-estradiol(E2)waschosenasthestudyobject.MicroecologicalsystemsinanaerobicporewaterconstructedinlaboratorywereusedtoanalyzetheimpactsofE2onmicrobialactivitiesandmethanogenicfunction.TheresultsshowedthatE2hadanobviousinhibitioneffectonmicrobialactivitiesunderanaerobicconditionwhileitalsohadaregularityeffectonmethaneproductionrateofwater.Whentheconcentrationswere≤0.5ng/L,E2playedanenhancingroleinmethanogenicactivity.Butitinhibitedmethanogenesiswhentheconcentrationsexceeded1.0ng/L,andtheinhibitionenhancedwiththeincreaseofconcentrations.ThisresearchindicatedthatE2inlowconcentrationscanaffectmicrobialactivitiesandmethanogeniceffectinanaerobicwaterbody,thereforeinfluencetheself-purificationfunctionofwaterbodiesandemissionofmethane.Keywords:17β-estradiol;methanogen;anaerobicmicrobialactivity;methanogenesis环境雌激素（EnvironmentalEstrogens,EEs），亦称环境内分泌干扰物（EnvironmentalEndocrineDisruptors,EEDs），是指进入机体后，具有干扰生物体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统功能，从而破坏维持机体稳定性和调控作用的化合物[1]。迄今为止，被列入环境雌激素的化合物有70余种[2]，主要包括：甾体类雌激素，非甾体类合成雌激素，植物雌激素，杀虫剂，多氯联苯，增塑剂和重金属等[3]。其中，甾体类雌激素17β-雌二醇（E2），雌酮（E1）和17α-乙炔基雌二醇（EE2）最具雌激素效应[4]。环境雌激素广泛存在于各类环境中，特别是水体环境，其污染形势日趋严峻。在亚洲，Isobe等[5]分析了来自东京湾的20个表层底泥样品，发现17β-雌二醇（E2）的含量变化范围为ND（低于检测限，＜0.07ng/kg）~0.59ng/g（dw），雌酮（E1）含量变化范围则为0.05~3.60ng/g（dw）。在南美洲，Bertin[6]等从智利中南部9个采样点采集了54份海洋沉积物样品，每份样品中均可检出E1、3E2、E3和EE2，其中EE2含量最高，达到48.14ng/g（dw）。Froehner[7]等研究了巴西沿海红树林区表面沉积物的雌激素分布，结果表明EE2最为常见且含量较高，达到0.45-129.78ng/g，E1和E2的含量分别为0.02-49.27ng/g和0.03-39.77ng/g。在欧洲，Noppe[8]等对斯凯尔特河河口（比利时-荷兰）的雌激素污染进行了两年的研究，在水样和悬浮物中分别检出了E1和E2，其中，E1最常被检出，且其浓度可达10ng/L（水体中）和0.84ng/g（悬浮物中）。Pinto[9]等采集了北地中海的沿海海水样本研究雌激素活性，发现雌激素活性介于4.8%-59.03%之间（以E2（nM）的活性百分比计算），并且明显取决于采样位置（p=0.0013）和采样季节（p＜0.05）。在澳洲，Ying[10]发现昆士兰东南部的受纳水体中的雌激素浓度为1.32~11.79ng/L，而鳟鱼体内的雌激素浓度高达2.48~21.18ng/L。我国对环境雌激素的研究尚处于起步阶段，从已有的研究结果来看，中国水域也同样面临着雌激素的严重污染。Gong[11]等从珠江水域取得28份河流沉积物样品，发现沉积物中E1和E2的含量变化范围分别在1.3-10.9ng/g（dw）和0.9-2.6ng/g(dw)之间，并且这些化学物质的空间分布与沿河生活、工业废水排放等因素相关。此外，东江下游纳污水体雌激素效应水平在1.9-8.8ngEEQ/L之间[12]。即使长江（南京段）水体中雌激素的浓度也达到0.24-0.45ng/L之间[13]。由此可见，世界各国水体均面临环境雌激素污染问题，严重威胁着生态安全和人群健康。环境雌激素的污染可对水体生态系统中多种生物类群的生理和遗传产生影响，甚至对人类健康也会造成直接或间接的伤害。有研究表明，鱼类的雌雄同体、雌雄比例失调现象、人类的乳腺癌和睾丸癌等的发生均与环境雌激素的污染有关[14~17]。环境雌激素可通过妨碍、阻止和改变激素与受体的结合，影响细胞信号转导，从而对生态系统中物种的正常演替产生影响[3]。因此，从其在环境中污染的状况和其对生物的影响程度来看，环境雌激素污染已逐渐成为继全球气候变暖、臭氧层空洞之后的世界第三大环境问题。本文在实验室构建水体厌氧微生态系统，选择典型天然环境雌激素——417β-雌二醇（E2），分析在厌氧条件下17β-雌二醇污染对水体细菌产甲烷功能及厌氧微生物活性的影响规律，初步探索环境激素污染与水体主要温室气体（CO2和CH4）排放之间的相关关系。1材料与方法1.1实验室厌氧水体微生态系统的构建本试验的底泥样品和水样均同时采自中国长江南京段。将底泥样品置于实验室避光、通风处风干，经碾磨、过筛、混匀后，测定土样平均含水率。分别称量40.00g粉状底泥样品分装于200mL血清瓶中，各注入长江水样100mL。分别通入氮气（99.999%，南京特种气体有限公司，中国）5分钟后，以硅胶塞密封。以此方法构建实验室厌氧水体微生态系统45个。取其中24个体系，先以注射器抽出5mL血清瓶中气体，再注入5mLH2/N2混合气体（N285%，H215%，南京特种气体有限公司，中国），于28℃恒温培养箱（DK-GJ003，MEMMERT，德国）中静置培养72h，用于研究E2污染对水体厌氧微生物活性的影响。取剩余21个体系，先以注射器抽出5mL血清瓶中气体，再注入5mLH2/CO2/N2混合气体（N280%，H210%，CO210%，南京特种气体有限公司，中国），于28℃恒温培养箱中静置培养72h，用于研究E2污染对水体微生物产甲烷活性的影响。1.2E2污染处理方案E2污染前，以1.00mL气体进样器吸取体系中气体样品，分别使用气相色谱（GC-7890A，Agilent，美国）检测各体系中CH4或CO2浓度。将注入H2/N2混合气体的24个体系分成8组，每组设3个重复，再以注射器注入相同体积不同浓度的E2（99%，J&K，中国上海）溶液，使各处理组体系中E2的添加浓度分别为0.00ng/L、0.03ng/L、0.07ng/L、0.10ng/L、0.30ng/L、1.00ng/L、5.00ng/L、10.00ng/L。然后，再将各处理组放回28℃恒温培养箱中静置培养。前期每隔72h采集各处理体系内气体，分析其CO2浓度、体系气体压力和温度，连续3次；后期每隔48h采集气体分析，连续2次。5将注入H2/CO2/N2混合气体的21个体系分成7组，每组设3个重复，再以注射器注入相同体积不同浓度的E2溶液，使各处理组体系中E2的添加浓度分别为0.00ng/L、0.03ng/L、0.30ng/L、0.50ng/L、1.00ng/L、5.00ng/L、10.00ng/L。然后，再将各处理组放回28℃恒温培养箱中静置培养。前期每隔72h采集各处理体系内气体，分析其CH4浓度、体系气体压力和温度，连续3次；后期每隔48h采集气体分析，连续2次。1.3CH4和CO2浓度分析程序CH4和CO2气样浓度均采用GC-7890A（Agilent，美国）分析测定，该GC-7890A配备SS-2m×2mm×13XMS(60/80)色谱柱和CH4转化器/火焰离子化检测器（methanizer/FID）的组合系统。以高纯氮气（99.999%）为载气，其流速为3.0mLmin-1；分离柱温度为40℃，进样器温度为100℃，FID检测器温度为300℃。CH4和CO2的停留时间分别为2.2min和4.4min。本分析方法针对CH4和CO2的检测限分别是0.2μLL-1和0.03μLL-1。1.4数据处理方法运用OriginPro8和MicrosoftOfficeExcel2007软件对试验数据进行统计学处理。其中，CH4和CO2产生速率计算公式tmVPTppmMv3-101013252732734.22(1)式中，v为CH4或CO2的产生速度（μgg-1h-1）；M为CH4或CO2的相对分子量（g/mol）；ppm为气体体积浓度；T为气体温度（℃）；P为体系气体