酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

二、原理酵母核酸中主要是RNA（2.67％～10.0％），DNA含量很少（0.03％～0.516％），且菌体易于收集，RNA易分离。从酵母中提取RNA的方法很多，常用的有稀碱法和浓盐法。前者是利用稀碱使细胞壁溶解，这种方法提取时间短，但是RNA在此条件下不稳定，易分解；后者是在加热的条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，产品色泽较好。本实验主要目的是提取核酸进行核酸组分鉴定，对RNA稳定性要求不严格，故采用稀碱法。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的了解从酵母中提取RNA的原理、方法及其组分，掌握鉴定核酸组分的方法。核酸的水解可分为化学水解和酶促水解，化学水解又可分为酸水解和碱水解。DNA对碱稳定，所以一般用酸水解DNA可得到碱基、脱氧核糖和磷酸。由于RNA存在2’－OH，使磷酸二酯键对碱不稳定，碱解可获得单核苷酸；在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。加硫酸煮沸可使其水解，可获得核糖、磷酸、碱基（主要释放嘌呤碱，不易释放出嘧啶碱）。1.磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝;2.核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应;3.嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。三、材料和试剂干酵母定磷试剂……四、操作将5g酵母悬浮于15mL0.04M氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀（此步是实验能否成功的关键，至少10min）。将悬浮液转移至锥形瓶中。再用10mL0.04M的氢氧化钠溶液分两次洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。将锥形瓶置于沸浴上加热30min后，将锥形瓶置于自来水中冷却。将匀浆转移到离心管中，托盘天平上配平，离心4000r/min，8min，取上清液于洗净的锥形瓶中，并缓缓倾入二倍体积的PH=2.5酸性乙醇溶液。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，再配平，离心4000r/min，5min。弃去上清液，取沉淀，即RNA粗品。用1.5M的硫酸（约5ml）将沉淀分几次转移到玻璃试管内，用沸水浴加热10min（时间太短可能致使组分鉴定实验失败）制成水解液并进行组分的鉴定。3.磷酸：取一支试管，加入水解液1毫升和定磷试剂l毫升。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。2.核糖：取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中l0min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。1.嘌呤碱：取水解液1毫升加入过量（约等体积）浓氨水，然后加人约1ml0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。