酵母细胞壁对葡萄酒酵母生长代谢的影响

酵母细胞壁对葡萄酒中酵母发酵代谢的影响卢新军1，张方方2，许引虎3（1.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600；2.湖北省酵母功能重点实验室，湖北宜昌4430033.国家酵母技术研究推广中心，湖北宜昌443003）摘要酵母细胞壁也称为酵母皮，因其独特的生理活性功能已成为葡萄酒酿造的重要辅料之一。本实验在发酵过程中添加酵母细胞壁，研究其对酵母生长代谢的影响。研究发现，酵母细胞壁能显著促进酵母的生长繁殖，在含乙醇的葡萄汁中，添加酵母细胞壁能减轻乙醇对酵母的抑制甚至毒害作用，促进酵母的生理活性及生长代谢。1前言在葡萄酒的酿造过程中，发酵迟缓甚至停滞的不良异常状况是无法完全预知的，尤其是在白葡萄酒或桃红葡萄酒这种清汁发酵或含糖较高的葡萄酒发酵中，更容易产生此类不良生产事故，这是任何酿酒师都不愿意碰到的。发酵迟缓甚至停滞是由多种因素引起的，其中包括葡萄汁含糖量高抑制酵母生长、生存因子或营养的缺乏、酵母代谢产生的毒素的抑制作用、缺乏氧气、以及葡萄汁的过度澄清[1]。避免发酵迟缓甚至停滞，增加酵母的代谢繁殖能力和酵母细胞数量是至关重要的。酵母细胞壁也称酵母皮（yeasthulls），占酵母细胞干重的10%-25%[2]，在葡萄酒酿造中，酵母细胞壁能吸附酿酒过程中产生的有害的中链脂肪酸（如辛酸、癸酸）[3]、赭曲霉素A、具有苦味和涩味的多酚物质以及葡萄酒中的农药残留。酵母细胞壁提供生长因子，如甾醇，不饱和脂肪酸，脂类物质（如固醇），促进酒精发酵过程中酵母的生长[4]。在葡萄酒的发酵中添加酵母细胞壁能改善发酵，提高葡萄酒的质量，有助于葡萄酒品质提高[5]。图1酵母细胞壁结构[6]Fig.1Thestructureofyeastcellwall[6]正在进行酒精发酵的葡萄汁或停止发酵的葡萄汁中添加酵母细胞壁，能有效地避免发酵停滞/发酵延迟或促进酵母重启酒精发酵。国内外多种文章报道，酵母细胞壁可以促进酵母生长，防止发酵迟缓或发酵停滞[3]，法国波尔多大学早在上个世纪八十年代就开始研究酵母细胞壁对葡萄汁酒精发酵的影响，添加酵母细胞壁能促进发酵，增加酵母的生存力，在酵母生长的衰退期能保证酵母的活性。国际葡萄与葡萄酒组织OIV已将酵母细胞壁纳入国际葡萄酿酒药典中[7]，并在国外酿酒行业中获得广泛应用，中国酿酒法规中也对酵母细胞壁的使用定义、用量做了明确规范[8]，但国内对酵母细胞壁的研究仅处于理论综述水平，实际的应用研究还比较少，甚至处于空白水平。表1OIV国际葡萄酒酿酒药典中酵母细胞壁的主要成分[9]Table1ThemaincomponentsofyeastcellwallininternationalenologicalcodexOIV[9]成分含量（g/100g）干浸出物96±2蛋白质15±3脂肪20±2矿物质4±1甘露聚糖15±5葡聚糖55±5本项研究对酵母细胞壁改善葡萄酒酒精发酵过程中酵母细胞数量，以及在含有乙醇的条件下，酵母细胞壁对改善酒精发酵过程中酵母生长代谢的影响，同时对指导葡萄酒生产、优化酒精发酵、改善葡萄酒质量起到了很好的指导意义。2实验材料培养基：YPD液体培养基；葡萄汁：自制，经巴氏灭菌；酵母：葡萄酒酵母CEC01；酵母细胞壁：CW101，安琪酵母股份有限公司提供；蔗糖，无水乙醇，恒温培养箱，分析天平，皂土，YPD培养基，显微镜。3实验方法葡萄汁的制备：将新鲜葡萄除梗破碎，压榨取葡萄汁，添加60mg/l二氧化硫，果胶酶40mg/l，皂土1g/l，低温澄清。测定葡萄汁的糖、酸、pH。酵母母液的培养：将酵母接种到100ml的YPD液体培养基中，25℃，150rpm培养24h，接种前用显微计数法测定母液中的活细胞数。处理1：取300ml葡萄汁，葡萄汁的糖度为24brix，接种酵母，使葡萄汁中酵母的初始数量为106cells/ml。处理2：取300ml葡萄汁，葡萄汁的糖度为24brix，添加0.3g/l酵母细胞壁CW101和酵母母液，使葡萄汁中的酵母初始数量为106cells/ml。处理3：取300ml葡萄汁，葡萄汁的糖度为24brix，添加1g/l酵母细胞壁CW101和酵母母液，使葡萄汁中酵母初始数量为106cells/ml。处理4：取300ml葡萄汁，糖度为11.4brix，酒度为7%v/v，添加酵母母液，使葡萄汁中酵母初始数量为106cells/ml。处理5：取300ml葡萄汁，糖度为11.4brix，酒度为7%v/v，添加1g/l酵母细胞壁CW101和酵母母液，葡萄汁中酵母初始数量为106cells/ml。以上处理均重复两次，发酵在500ml的三角瓶中，25℃培养发酵，每天测定发酵的失重及酵母的活细胞数（显微计数法）。4结果与分析4.1酵母细胞壁CW101对酵母生长和发酵速率的影响图2糖度为24°Brix的小型发酵中活细胞总数的变化曲线注：CW101-0.3：表示添加0.3g/l细胞壁；CW101-1：表示添加1g/l细胞壁；对照不添加酵母细胞壁。FIG.2.Cellviabilityin24°Brixfermentationsinoculatedat1x106cells/ml.CW101-0.3：0.3g/lyeastwall；CW101-1：1g/lyeastwall.Thecontrolexperimenthadnoyeastwall.酵母的生长时期分为延滞期、对数生长期、平稳期和衰亡期，葡萄汁的发酵过程中酵母的生长曲线如图2。酵母的初始浓度为106cells/ml，酵母细胞壁CW101的添加量分别为0.3g/l和1.0g/l，对照未添加酵母细胞壁。延滞期又称适应期，酵母接种到新的环境,在一段时间里并不马上分裂，酵母的数量维持恒定，或增加很少，从图2中可以看出添加酵母细胞壁CW101可以缩短酵母生长的延滞期。指数生长期，酵母生长速度快，繁殖能力强，从图2中可以看出，添加酵母细胞壁CW101的发酵中酵母数量的增长比对照的酵母数量增长得快。稳定期，酵母的数量基本保持在一定数量，但添加酵母细胞壁CW101的发酵中，该期酵母数量显著高于不添加细胞壁的发酵。在葡萄汁发酵过程中，酵母数量的最大值均超过108cells/ml（图2），而添加酵母细胞壁CW101对酵母的生长具有明显的影响，酵母细胞壁的添加量为0.3g/l，最大酵母细胞数比对照增加28%（表2）；添加1g/l酵母细胞壁，最大酵母细胞数比对照增加42.4%（表2）。添加酵母细胞壁CW101对发酵的最大发酵速度也有影响，空白对照、添加0.3g/l和1g/l的细胞壁最大发酵速度分别是21.8、24.5和26.9g/l·d（表2）。在酵母进入衰亡期时，酵母的代谢能力下降，同时酵母数量也开始下降，在这一时期容易导致发酵停滞或发酵延迟。从图2中可以看出添加细胞壁的发酵中，在发酵后期酵母的细胞数均明显高于对照中的酵母细胞数，添加0.3g/l和1g/l酵母细胞壁CW101的发酵分别比对照高35%和65%。表2.酵母细胞壁对酵母生长和发酵速率的影响Table2.EffectofYeastwallsonYeastGrowthandFermentationRate葡萄汁添加物mustaddition初始酵母数(cells/ml)initialyeastcells最大酵母数(106cells/ml)maximumyeastcells最大发酵速度(g/l·d)maximumfermentationrate无none10611821.8细胞壁（0.3g/l）yeastwalls10615124.5细胞壁（1g/l）yeastwalls10616826.93.2逆境条件下酵母细胞壁CW101对酵母生长的影响众所周知，营养不足和毒素（乙醇、中链脂肪酸等）抑制作用是发酵停滞或发酵迟缓的主要原因。在葡萄酒发酵过程中，酵母将糖转化成酒精，然而酒精对于酵母具有一定的毒害作用，本实验在7%v/v的乙醇、11.4°brix的糖的葡萄汁中添加酵母细胞壁，研究酵母细胞壁CW101对酵母生长的影响。图3中表示含有乙醇的葡萄汁中酵母数量的动态变化。含有乙醇的葡萄汁中，乙醇对酵母有明显的抑制作用，在指数生长期，酵母的生长速度十分缓慢，且最大的活细胞数仅64.5×106cell/ml（表3），而添加酵母细胞壁CW101能显著促进酵母的生长，酵母的最大细胞数达到101×106cell/ml（表3），可见酵母细胞壁CW101能有利于酵母提高对乙醇的耐性，增加细胞活力。图3添加乙醇的葡萄汁的小型发酵的活细胞总数的变化曲线注：Control：含糖量为24°Brix；Ethanol：含糖11.4°Brix和乙醇7%v/v；ethanol+cellwalls：含糖11.4°Brix，添加7%v/v乙醇和1g/l酵母细胞壁FIG.3Cellviabilityinalcohol-adjustedmustfermentationsinoculatedat1x106cells/ml.Control：contained24°Brixsugar；Ethanol：contained7%v/vethanoland11.4°Brixsugar；ethanol+cellwalls：contained7%v/vethanol,1g/lyeastwalland11.4°Brixsugar发酵过程中，酵母细胞数量的不同导致了发酵速度的不同，添加细胞壁能提高酵母的发酵速率。含有乙醇的葡萄汁中添加1g/l的酵母细胞壁CW101的发酵处理中，其最大发酵速度为14.8g/l·d，比未添加细胞壁的发酵处理提高18.4%。表3在含有乙醇的葡萄汁中添加酵母细胞壁对酵母生长和发酵速率的影响Table.3Effectongrowthofyeastandfermentationratebyadditionofyeastwallsinalcohol-adjustedmust葡萄汁添加物mustaddition初始酵母数(cells/ml)initialyeastcells最大酵母数(106cells/ml)maximumyeastcells最大发酵速度(g/l·d)maximumfermentationrate无none10611821.8乙醇（7%v/v）Ethanol10664.512.5乙醇(7%v/v)+细胞壁(1g/l)10610114.8Ethanol+yeastwalls4结论在酒精发酵过程中，酵母代谢产生一些中链脂肪酸，如癸酸、辛酸等。这些脂肪酸能抑制酵母的生长[10]，而发酵过程中添加酵母细胞壁，细胞壁对于中链脂肪酸具有吸附作用，同时细胞壁中含有酵母生长所需要的生长因子，因此促进酵母的生长。研究发现葡萄汁中缺乏可同化氮、不饱和脂肪酸和甾醇能导致发酵停滞，添加氮源和麦角甾醇/吐温80能促进酵母的生长，保证发酵进行。添加酵母细胞壁与添加麦角甾醇/吐温80具有同样的作用，能促进发酵速率和酵母生长[10]。酵母细胞壁中富含麦角甾醇和不饱和脂肪酸，因此促进酵母的生长从而提高发酵速度，避免发酵停滞。本实验中，酵母细胞壁CW101能有效的促进酵母的生长，增加发酵过程中酵母的数量，添加0.3g/l和1.0g/l的酵母细胞壁CW101的发酵中期最高细胞数分别比对照增加28%和42.4%（表2），酵母细胞数量的增加导致发酵速度提高。添加酵母细胞壁还能显著改善发酵后期酵母的数量，添加0.3g/l和1g/l酵母细胞壁CW101的发酵后期中酵母细胞数分别比对照高35%和65%。在含有乙醇的葡萄汁的发酵中，酵母细胞壁CW101能减轻乙醇对酵母的抑制作用，显著提高发酵过程中酵母的细胞数量[11]，促进葡萄酒的发酵，防止发酵停滞或发酵迟缓。在含11.4°brix的糖和7%v/v的乙醇葡萄汁中，添加1g/l的酵母细胞壁CW101的发酵中最大细胞数达到101×106cell/ml，未添加酵母细胞壁的发酵中其最大的活细胞数仅64.5×106cell/ml。因此在葡萄酒的发酵过程中添加酵母细胞壁CW101能显著的促进酵母的生长，从而提高酵母的发酵速度，防止发酵停滞或迟缓，保证酒精发