酵母菌的培养和观察

酵母菌的培养和观察目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。步骤1．观察酵母菌（1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。（2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。2．培养酵母菌（1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。（2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。注意事项1．观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其它杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其它杂菌区分开来。2．发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。分析和讨论酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：1．C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦（有氧呼吸）2．C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦（缺氧呼吸）建议培养酵母菌还可以采用下列两种方法。1．用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养（1）取10克豆芽放入100毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。在滤液里加5克蔗糖和5毫升乳酸，配成液体培养液。（2）把鲜酵母半块或老面（发酵后晾干的面粉团）打碎，投入培养液中，放在黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵母菌。2．用巴斯德培养液培养酵母菌需要的无机营养来自外界环境。如果在培养液内适当增加氮、磷等元素，效果会更好。巴斯德培养液的配方如下：蔗糖15克，碳酸铵1克，磷酸氢钾0．2克，磷酸钙0．02克，硫酸镁0．02克，蒸馏水100毫升，培养方法跟上述的相同。于运联中学生物学实验大全1994年12月酵母菌的培养与转形作用Ⅰ.目的酵母菌（Saccharomycescerevisiae）是一种很有用的真核生物，他拥有生物的特性，可用原核生物的方式培养，其基因组较小，复制时间短，可作为基因分析，在分子生物学研究上的突破，很多都是以它为材料。在工业上酵母菌也很重要，例如：啤酒、面包、酒、重组胜和蛋白质之合成皆与酵母菌有关。在重组DNA技术中，酵母菌（yeast）乃是一种很重要的寄主生物，可用质体DNA为媒介物引入外来DNA并表现之。转型技术与大肠杆菌相似，但其方法需修饰以瓦解其细胞壁，常用的两种方式进行酵母菌的转型作用，一是使酵母菌形成Spheroplast，此法较麻烦需将细胞壁去掉，另一种是用碱性阴离子（例如：LiCl或RbCl）加上热休克快速地处理完整的细胞，本实验用后者来实行，收集对数生长期的酵母菌细胞，经碱性阴离子及热休克处理，可使细胞外鞘发生变化，有利于吸收质体DNA，正如大肠杆菌一样（参照实验5），不同的因子会影响效率，质体DNA吸收能力与质体的大小、DNA的构形、寄主品系、筛选步骤有关，与大肠杆菌的转形作用相比有显着的差别是转形效率，酵母菌的转型效率在每1mg质体DNA中，约可获取103-104转形细胞。II.酵母菌的培养1.仪器用具：a.30℃恒温箱b.酒精灯c.接种环2.药品与试剂：a.yeast菌株：EGY48〔MAT,ura3,his3,trp1,LexAop(x6)-LEU2〕YM4271〔MATaura3-52,his3-200,lys2-801,ade2-101,ade5,trp1-901,Leu2-3,112,try1-501,gal80gal4ade5::hisG〕Y187〔MAT,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,Leu2-3,112,gal4,gal80,cyhr2,LYS2::GALUAS-HIS3TATA-HIS3,URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-LacZ〕Y190[MATa,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-90,leu2-3,112,gal4,gal80,cyhr2,LYS2::GAL1uas-HIS3TATA-HIS3,URA3::GAL1uas-GAL1TATA-lacZ]b.YPD培养液、培养基（参照实验4）3.方法与步骤：１）单一菌落（singlecolony）之分离，请参照实验4。分别将酵母菌养于YPD培养液或培养基中，至于30℃之培养箱中约3-5天。２）隔周实验前，取出酵母菌落并观察。III.酵母菌转形作用1.仪器用具：a.30℃培养箱b.离心机c.干浴器d.冰浴2.药品与试剂：a.minimalsynthuticdropout（SD）baseagar（clontech）b.–Urac.1xTE/LiAc（0.1MLiAcinTE溶液）d.40﹪PEG4000e.DMSO3.方法与步骤：１）制备胜任酵母菌的前一天，接种酵母菌EGY48于3mlYPD培养液中，置于30℃恒温箱中振荡培养（230-250rpm）过夜。２）准备10mlYPD培养液，加入300l过夜菌液，使OD600=0.4~0.6。３）在室温下以2200rpm离心5分钟，倒去上清液，加入5ml水悬浮酵母菌。４）在室温下以2200rpm离心5分钟，倒去上清液，加入新鲜的100l1xTE-LiAc悬浮。５）加入0.1~0.5gp8OP-LacZ质体DNA及0.1mg片段精子DNA携带者。６）加入600lPEG-LiAc（0.1MLiAc,40﹪PEGinTE）混匀，置于30℃恒温箱中振荡培养（200rpm）30分钟。７）加入70lDMSO，混匀并热休克42℃15分钟，迅速至于冰浴中2分钟。８）在室温下以14,000rpm离心5秒，倒去上清液，以100lTE悬浮并涂于SD/-Ura培养基中，置于30℃恒温箱中3~5天。~life-science/exp/choice.htm实验4质体DNA之基本操作技术I.目的本实验介绍培养液（broth）或培养基（plate）的制备、大肠杆菌的培养、菌种保存与生长曲线所使用的基本技术。II.培养液（基）的制备1.培养细菌或酵母菌（yeast）其培养基必须提供下列几种基本的营养条件：（1）碳源作为能源（2）水分（3）氮源（4）磷（5）硫（6）不同的矿物质养分，如铁和镁。大肠杆菌和酵母菌能在只有一种碳源（如葡萄糖）与简单的氮源（如氯化铵、硫化铵及磷、硫等矿物质）的简单培养基中生长，酵母菌则还需要几种维生素。实验研究上常用到一些复杂的培养基，其主要成分则由复杂的养分（包括植物或动物）所提供的一些不详萃取物。例如LB和YPD培养液，其主要成分是酵母菌萃取物（yeastextract）和蛋白月柬（peptone,一种水解的蛋白质）所组成，这些材料和胺基酸以及不明的辅助因子混合在一起，如维生素等形式提供不同的碳源和氮化合物。液体培养基就是将各成分溶于水中即可，若加入洋菜（agar，从红藻中萃取出来的复杂萃取物，与洋菜胶agarose不同，请勿用错）则成固体培养基。洋菜是固体微生物培养基理想的凝固剂，因它具有良好的溶解特性，但对大部分细菌及酵母菌而言则不具营养价值。固体洋菜在90~100C会溶解，液体洋菜在约42C时凝固。灭菌步骤可去除所有活的微生物，培养基在做纯系培养时必须将所有的微生物去除，培养容器则要密封或用棉花、锡箔盖住以避免灭菌后又遭污染。纯系培养过程中所用的液体及容器可用不同的方法消毒，包括高温、放射线照射、过滤等将微生物杀死。制备培养基常需要高压灭菌锅（autoclave），让培养基在特定时间内暴露于高温高压中，通常是121C的高温，蒸汽压15Psi，灭菌20分钟。2.仪器用具：a.高压灭菌锅（autoclave）b.磁性搅拌器c.天秤d.pHmetere.水浴槽f.无菌操作台3.药品及试剂：a.Tryptone（代替peptone）b.yeastextractc.NaCld.Agare.ampicillin4.方法步骤：全班区分数组各制备不同的培养液或培养基。（A）LB培养液：1）在500ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract+1gNaCl，加水至100ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。若用玻瓶装，则旋松盖口（待灭菌后降温再旋紧）。2）高温灭菌锅消毒。注：高压灭菌后必须等它慢慢排气，只有当气体完全排除后，才能安全地打开灭菌锅，戴耐热手套取出材料，消毒20分钟实际需要约40分钟，因为还要把空间加热及排气时间包括在内。（B）LB固体培养基：１）在500ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract+1gNaCl+1.5gagar，加水至100ml刻度并用磁性搅拌器混合，agar此时无法溶解成悬浮状，瓶口以铝箔纸盖住。２）高温灭菌锅消毒。３）灭菌后，小心将瓶放在50C水浴中，使其降温30分钟。４）在培养基凝固前，倒入微生物用的培养皿（petridish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明LBplate及日期，放在室温或4C中备用。（C）Ampicillinplate：1）如同前项（B）步骤1）至3）。2）在培养基凝固前，迅速加入ampicillin使成最终浓度为100g/ml，摇晃均匀，倒入微生物用的培养皿（petridish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明Ampplate及日期，放在室温或4C中备用。（D）YPD培养液：1）在250ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract，加水至50ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。2）高压灭菌消毒。3）冷却至55C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为2%。（E）YPD培养基：１）在250ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract+1gagar，加水至50ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。２）高压灭菌消毒。３）冷却至55C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为2%。4）倒入微生物用的培养皿（petridish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明YPDplate及日期，放在室温或4C中备用。III.大肠杆菌的培养（A）单一菌落（singlecolony）之分离：1.利用微生物的生物技术作纯系（pureline）的保存，常依据纯系培养，常见的有稀释技术或画线法，本实验将介绍后者，乃在培养基表面把混合培养的菌涂开或画成线，让个别的细胞分开。每个分离的细胞会长成一个菌落（colony），可获得一个纯系培养。2.仪器用具：a.37C恒温箱b.酒精灯c.接种环3.药品及试剂：a.E.coli菌株:DH5b.LB及LBp