酶促反应动力学实验教案

生命科学与技术学院生化实验（上）1生物化学实验（上）实验一酶促反应动力学实验·底物浓度对酶活性的影响·pH对酶活性的影响·温度对酶活性的影响华中科技大学生命科学与技术学院2014级生物化学小老师第一组生命科学与技术学院生化实验（上）2酶促反应动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定【实验目的】1.了解底物浓度对酶促反应速率的影响2.掌握米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km的方法。【实验原理】1.米氏方程：(1)式中：v表示酶促反应速率，表示酶促反应最大速率，[S]表示底物浓度，Km表示米氏常数。v=Vmax×[S]/（Km+[S])，这个方程称为Michaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中Km值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。由此可见Km值的物理意义为反应速度v达到1/2Vmax时的底物浓度（即Km=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。可用Km的值鉴别不同的酶。当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物S是个零级反应。就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。米氏常数Km是酶促反应速度v为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。这可通过用[S]取代米氏方程中的Km证明，通过计算可得v=Vmax/2。2.Km值的测定主要采用图解法，有四种：生命科学与技术学院生化实验（上）3①双曲线作图法（图a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。②Lineweaver-Burk作图法—双倒数作图法（图b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver-Burk方程式：(2)以1𝑣对1[S]作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距即为—。③Hofstee作图法（图略,不要求）把（2）式等号两边乘以Vmax，得：(3)以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。④Hanas作图法（图略，不要求）把（2）式等号两边乘以[S],得：(4)以v对作图，这时斜率为，纵截距为。生命科学与技术学院生化实验（上）4（a）(b)本实验主要以双倒数法，即Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下，准确反应15分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长660nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度（思考分析这样处理的原理及合理性），即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。生命科学与技术学院生化实验（上）5【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴锅；2.721型分光光度计；3.试管；4.吸量管；5.移液枪；6.烧杯。试剂：1.酚试剂2.2.5mM磷酸苯二钠基质液3.碱性缓冲液（pH10.0）4.碱性磷酸酶【注意事项】1.加入碱性磷酸酶的量要准确，并且提前进行预热。2.保温时间要准确，不同试管加热时间须保持一致，注意计时方法。3、磷酸苯二钠为2.5mmol/L，注意与后两个试验区分。4、使用分光光度计和移液枪时注意操作步骤。生命科学与技术学院生化实验（上）6【实验步骤】取6支试管按下表加入试剂：0号管切勿加酶！0123452.5mM磷酸苯二钠（mL）1.00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）0.20.80.60.40.2------碱性缓冲液（pH10.0）（mL）1.01.01.01.01.01.0混匀后，37℃预温5分钟。注意：碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃，再滴加到试管中参与反应碱性磷酸酶液（mL）------0.20.20.20.20.2混匀后，37℃水浴15分钟（准确计时）。注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。（用移液枪加）2）酶促反应溶液总体积2.2mL。3）第0管不加酶，基本无反应。酚试剂（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(mL)2.02.02.02.02.02.0混匀后，37℃水浴15分钟（准确计时）。注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试剂后酶促反应停止。2）Na2CO3提供碱性环境，加入Na2CO3后试剂才显色，37℃水浴使显色充分。以0号管调零，在660nm波长处比色。生命科学与技术学院生化实验（上）7【结果处理】1．将各管光密度和底物浓度记入下表:管号12345O.D1O.D2O.D3O.D（均值）1/O.D[S]请自行计算1/[S]2．以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver-Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值,并分析实验结果。实验（二）——PH对酶活性的影响【实验目的】了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】大部分酶活力受其环境pH的影响。在一定的pH下，酶反应具有最大速度，高于或低于此值，反应速度下降，通常称此pH值为酶反应的最适pH。不同的酶具有不同的最适pH。【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴锅；2.试管和试管架；3.移液枪及枪头；4.721型分光光度计；5.移液管。试剂：生命科学与技术学院生化实验（上）81、0.01M磷酸苯二钠。2、碱性磷酸酶液（pH=10）。3、不同pH缓冲液。4、酚试剂和10%Na2CO3溶液。【注意事项】1、碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃，再滴加到试管中参与反应2、注意磷酸苯二钠为0.01mmol/L，与实验一不同【实验步骤】取六支洁净试管，编号后按表操作：管号0123450.01M磷酸苯二钠（mL）0.30.30.30.30.30.3缓冲溶液蒸馏水1.2mLpH91.0mLpH101.0mLpH111.0mLpH121.0mLpH121.0mL混匀，置于37℃水浴5min。注意：碱性磷酸酶溶液应先置于水浴锅中预热到37℃，再滴加到试管中参与反应碱性磷酸酶液（mL）-----0.20.20.20.20.2混匀，再置于37℃水浴15min。酚试剂（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(mL)2.02.02.02.02.02.0混匀后，置于37℃水浴中再次保温15min，然后以第0管调零点，用660nm波长比色。以各管pH为横坐标，光密度为纵坐标绘制曲线，从曲线上可大致得出碱性磷酸酶的最适pH。【结果处理】记录现象（或比较吸光度值），以pH为横坐标、吸光度为纵坐标制图，根据图象做出合理分析。生命科学与技术学院生化实验（上）9实验（三）——温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反应速率的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴锅；2.试管和试管架；3.移液枪及枪头；4.721型分光光度计；5.移液管。试剂：1．碱性缓冲液：同实验一中碱性缓冲液配制（pH=10）；2．0.01M磷酸苯二钠；3．酚试剂；4．碱性磷酸酶液；5．10%Na2CO3溶液；【注意事项】1.加入碱性磷酸酶的量要准确。2.保温时间要准确，注意计时方法。3.将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液，立即摇匀之后在室温下放置15min。生命科学与技术学院生化实验（上）10【注意事项】1.加入碱性磷酸酶的量要准确，并且提前放入不同温度水浴锅中进行预热。2.对反应温度的控制要严格，不同温度下反应的时间必须保证一样，建议每隔一分钟向装有底物的试管中加入酶液，便于用秒表计时。3.将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液，立即摇匀之后在室温下放置15min。4、注意磷酸苯二钠为0.01mmol/L，与实验一不同【实验步骤】取6支洁净试管，参照下表加入试剂：0123450.01M磷酸苯二钠（mL）0.30.30.30.30.30.3碱性缓冲液（mL）1.21.01.01.01.01.0混匀后，将0~5管分别置于室温、37℃、50℃、60℃、70℃和80℃中水浴5min；注意：碱性磷酸酶溶液应先放于不同水浴锅中预热，再滴加到试管中参与反应碱性磷酸酶液（mL）------0.20.20.20.20.2混匀后，继续原温度水浴加热15min（准确计时）。酚试剂（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(mL)2.02.02.02.02.02.0混匀后，室温放置15min后，以第0管调零，用660nm波长比色。再以温度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制曲线。从曲线上可得出此实验条件下碱性磷酸酶的最适温度。【结果处理】记录现象（或比较吸光度值），以温度为横坐标、吸光度为纵坐标制图，根据图象做出合理分析【思考题】生命科学与技术学院生化实验（上）111.反应时间15min是经过实验得出的较好结果，试分析时间长了或短了会有何影响?2.回答实验原理中括号中的思考题3.第二个实验中两次水浴的目的分别是什么，去掉其中一个行不行，为何？附录仪器操作规范与注意事项移液枪使用注意事项：1.不使用时，请竖直放置；2.枪头为一次性，可多次吸取同一种液体，不可吸取不同液体；3.吸液时，拇指向下压到有阻力，然后轻轻释放（一定不能松开拇指），防止液体因惯性冲入移液管；4.吸液时，枪头内不能有气泡。规范操作：取移液枪调至所需加液用量，套上枪头，大拇指摁下按钮到刚有阻力时将枪头伸入液体中，轻轻吸上液体，放出液体时按钮按到底即可。移液管使用注意事项：1.使用前必须清洗干净，用吸水纸将尖端内外的水除去，然后用待吸溶液洗三次，洗的时候，吸取液体约占管身的三分之一，将移液管润洗即可。洗过的溶液应从流液口放出弃之。2.吸收溶液时，管尖应深入液面10-20mm,并随液面下降而下降，用洗耳球在移液管另一侧将液体吸入管中，（切忌用嘴吸）吸液时，手应慢慢放松洗耳球，避免让移液管内液体上升太快导致液体冲入洗耳球中；另外不要让液面升得太高，使管壁沾附过多的液体，以免在调定液面和排液时流下来，影响容量的准确度。3.调定液面或放液时吸管均应垂直放置，其流液口与容器内壁相接触，接受容器须倾斜30°，移液管者始终保持垂直。为保证液体完全流出，要等待约3秒钟，方可拿开。4.吸管内的溶液按规定方法排出后，移液管尖嘴的残留液，如果移液管上没有标明“吹”的字样，不能排到接受容器中，若有，则用洗耳球将剩余液体吹入。注：当吸取有毒或腐蚀性液体，可选用有安全泡的吸管，并使用吸具（如洗耳球等）操作移液管规范操作：使用移液管前，先看移液管上的标记，刻度线位置，检查管头是否损坏。润洗时，先慢慢吸入移液管长度的1/3左右，将移液管横置，并转动移液管使溶液接触到刻度线以上的部分，进行润洗。随后将溶液由管下口弃去，并用洗耳球吹去残余液体。反复润洗三次。生命科学与技术学院生化实验（上）12分光光度计使用步骤一.预热使用前插上插头。打开开关，预热20min。二.选定波长三．调零：1.将黑色比色皿和参比液放入培养皿内，并将黑色培养皿拉入光路，按模式键调至T，按0%键将透光率调为0。2.拉动伸缩杆，将参比液拉入光路，按100%键，将透光率调为100。3.再按模式键调至A模式，显示屏显示0.00即可。四．样品测定将待测样品拉入光路，显示屏上的示数即为光密度值。保持光路中的样品不变，打开