酶技术讲座

酶技术讲座一．酶的概念（一）酶的生物学意义酶是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。酶的生理学意义：①强的催化效能②高度的专一性③酶促反应没有副反应④酶的催化作用是受调控的⑤酶的化学本质是蛋白质，具有蛋白质的一切性质。（二）酶的化学本质大多数酶是蛋白质1926年美国Sumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。某些RNA有催化活性1982年美国T.Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.colitRNA的前体加工。Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。抗体酶（abzyme）抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。有些DNA也有催化活性1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。（三）酶是生物催化剂1．酶与一般催化剂比较（共性）用量少而催化效率高：细胞内含量少；能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生变化；降低反应所需的活化能2．酶作为生物催化剂的特性（1）高的催化效率就分子比(molecularratio)而言，以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高107～1013倍，比非催化反应高108～1020倍。（2）高的专一性（3）温和的反应条件（4）酶在体内受到严格调控：如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。（5）酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关（四）酶的组成1．单纯蛋白质酶类2．结合蛋白质酶类全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子）二酶的命名和分类1961年国际酶学委员会（enzymecommission）提出的酶的命名和分类方法。（1）标明底物，催化反应的性质（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。2．习惯名称（recommendedname）（1）底物（2）反应性质（3）底物，反应性质（4）来源或其它特点国际系统分类法1．分类:6大类酶，氧化还原、转移、水解、裂合、异构、连接注意顺序不能变！2．编号:用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“·”隔开，前面冠以EC（为EnzymeCommission）。EC类.亚类.亚亚类.排号，如EC1.1.1.1酶的分离、纯化及活力测定（一）酶的分离纯化1．选材2．破碎细胞3．抽提4．去核酸、去多糖5．纯化6．保存由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1．全部操作在低温。2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。（二）酶活力的测定酶活力（enzymeactivity,也称酶活性）酶活力的测定1．测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度（initialvelocityorinitialspeed）（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使[S][E]。酶的作用动力学（kinetics）（一）底物浓度对酶反应速度的影响有关米氏常数说明几点（1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关（2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。（3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关，所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。（4）Km与Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情况下即和底物的亲和力。比活力＝酶活力蛋白质浓度（二）酶浓度对酶反应速度的影响1．反应速度与酶浓度成正比[S][E]V∝[E]（三）pH对酶反应速度的影响1．酶反应的最适pH（optimumpH）2．pH影响反应速度的原因(1)pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。(2)过高、过低的pH导致酶蛋白变性。（四）温度对酶反应速度的影响1．最适温度（optimumtemperature）最适温度与最适pH一样，也不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度,溶液的离子强度,pH,反应时间等的影响。（五）激活剂对酶反应速度的影响（六）酶的抑制作用和抑制作用动力学1、不可逆抑制作用（irreversibleinhibition）2、可逆抑制作用(reversibleinhibition)及其动力学（1）竞争性抑制作用（competitiveinhibition）（2）非竞争性抑制作用（noncompetitiveinhibition）（3）反竞争性抑制作用（uncompetitiveinhibition）酶的专一性及活性中心（一）酶的专一性（特异性，specificity）1、绝对专一性（absolutespecificity）2、相对专一性（relativespecificity）（1）基团专一性（groupspecificity）（2）键专一性3、立体专一性（stereospecificity）（1）D-，L-立体异构专一性（2）几何异构专一性（3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。酶的活性中心（activecenter）活性中心的概念酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，这个部位称酶的活性中心。组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和ASP的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的侧链基团。青霉素酰化酶1.青霉素G酰化酶是由α亚基和β亚基组成的大分子蛋白质，α亚基分子量为20~25KD,β亚基分子量为60~65KD。活性中心在β亚基，但没有α亚基时，也没有活力。2.青霉素G酰化酶在巨大芽孢杆菌、大肠杆菌、醋酸杆菌、粘性节杆菌和假单孢杆菌等众多微生物中都存在。3.其活性中心为丝氨酸残基，不同来源的酶，其底物专一性明显不同，活性中心也不同。青霉素G酰化酶能特异性催化青霉素6位侧链酰胺基裂解形成6-APA和苯乙酸；还能催化头孢类抗菌素及其中间体7-ADCA的7位侧链酰胺基裂解。青霉素G酰化酶也能特异性催化6-APA和7-ADCA与相应的侧链合成制备阿莫西林和头孢氨苄。4.起初，人们使用溶液状态的酶用于催化裂解反应，但存在难以回收利用，成本高，易将酶混入最终产品，影响产品质量等问题。所以在70年代，人们将酶固定到载体上后在应用5.提取：（1）巨大芽孢杆菌（2）大肠杆菌6.固定化：基本结构：聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸。活性基团：环氧基或氨基7.杂酶：酯酶8.影响酶活力的因素：有机溶媒，苯乙酸，金属离子D－氨基酸氧化酶D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase,DAO,EC1.4.3.3）是以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄素酶，它广泛存在于哺乳动物人、鼠、猪、兔等的肝、脑、肾等组织器官中,也存在于微生物如藻类、曲霉、链孢霉、细菌、变形三角酵母、纤细红酵母、胶粘红酵母、假丝酵母等细胞内。不过具有广泛工业应用价值的的酶的来源是来自红酵母（Rhodotorulagracilis）和变形三角酵母（Trigonopsisvariabilis）的DAO（RgDAO和TvDAO）。DAO能特异性催化D－氨基酸的α－氨基氧化脱氨基形成相应的α－酮酸和氨。由于它对催化反应底物有高度的立体选择性,可广泛应用于生物传感器、D－氨基酸的定量分析、L－氨基酸和α－酮酸的生产。分子量：39.3或42.6不同来源的DAO等电点有差异。主要杂酶：酯酶，内酰胺酶，过氧化氢酶影响酶活的主要因素：温度（低温和高温），重金属，Fe2＋和双氧水同时存在，染菌头C裂解中典型的副产物：7－ACA－亚砜，去乙酰头孢菌素衍生物，keto－7－ACA活性中心：精氨酸GL－7－ACA酰化酶来自假单胞菌。α亚基分子量为18KD,β亚基分子量为58KD等电点：8.4，8.6活性：keto－去乙酰－7－ACA1／4，头C1％，keto－7－ACA无影响活性的因素：PH5－10稳定，温度：50以下，戊二酸和醋酸（40－60mM）能抑制CAE和GAC活力，重金属主要杂酶：酯酶，内酰胺酶活性中心：ser