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酶联免疫法在食品分析检测中的应用lyz摘要:介绍了酶联免疫吸附实验原理,阐述了该技术在食品安全检测中的应用研究进展。讨论了该技术的发展趋势及其应用前景关键词:酶联免疫法;食品分析;检测TheApplicationofELISAinFoodAnalysisDeterminationStudentmajoringinfoodengineering，YizheLiuAbstract:ThetechnologyofEnzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)wasbrieflyintroduced.Meanwhile,theapplicationofELISAinanalysisoffoodsafetyanddeterminationprogresswerecommented,includingpesticideresidue,animaldrugresidue,foodtoxins,pathogenicmicroorganismsandthecompositionsofgeneticallymodifiedfoods,etc.ThedevelopmenttendencyofELISAanditsapplicationprospectwerediscussed.Keywords:Enzyme-linkedImmunosorbentassay(ELISA);Foodanalysis;determination1引言我国的食品安全问题已不再单纯的是一般的质量问题，食品自然甚至人为地污染日趋多样化和复杂化，紧抓食品安全控制成为了关系国计民生的大事，人民和政府的高度重视迫使食品科技不断增加新的检验项目，利用新的科技手段不断提高检验水平和质量、效率。现今，食品安全检测正朝着快速、灵敏、简便的方向发展。酶联免疫技术正是迎合了这一方向而被越来越多地应用于食品安全检验领域的。2酶联免疫吸附技术概述酶免疫技术是20世纪60年代在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的一种新技术，1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即:酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)[1]。ELISA是目前应用最广泛、发展最快的一项酶免疫技术，它是将可溶性抗原（抗体）吸附到某种固相表面，并保持抗原（抗体）免疫活性，这样在与标本中抗体（抗原）反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤[2]。2.1ELISA测定原理图1ELISA测定原理（以间接法为例）ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对各种微量有机物含量进行测定。ELISA检测技术的基本原理是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。在测定时,酶标抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合,受检样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使抗原抗体复合物与其他物质分开。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈一定的比例关系。故可根据呈色的深浅进行定性分析或通过酶标仪进行定量测定。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度[3,4]。2.2ELISA分类ELISA方法的分类至今还没有一个统一的标准[5],最常用的测定方法有三类:(1)间接法测定抗原:将特异性抗原包被在固相载体上,从而形成固相抗原,加入待检样品(含相应抗体),抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物,再加入酶标记的抗抗体(又称二抗)与上述复合物结合,此时加入底物,复合物上的酶则与催化底物反应而显色,由于每步之间均有冲洗步骤。因此,若样品中不含相应的抗体,酶标抗体则将被洗掉,底物不显色而呈阴性反应;若样品中含相应的抗体,底物显色则呈阳性反应。(2)双抗体夹心法测抗原:将已知的特异性抗体包被在固相载体上形成固相抗体,加入待检样品(含相应抗原),其中抗原与固相抗体结合成复合物,再加入特异性的酶标抗体,使之与已形成的抗原-抗体复合物结合,当加入底物时,酶则催化底物而显色,根据颜色的有无和深浅,对待测抗原进行定性和定量分析。(3)竞争法测抗原:将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,加入待测样品(含相应抗原)和相应的一定量的酶标抗原,样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测样品中抗原含量越高,则与固相抗体结合的越多,使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少,甚至没有机会结合,这样加入底物后就不显色或显色很浅,显色深者为阴性。前面两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原,通常用于临床诊断,而竞争法是测定小分子抗原的方法,适用于食品安全的检测。由于食品安全检测需测定的物质大都是低分子量的,但免疫动物产生抗体的抗原分子量要大(至少50000Da)。因此,首先小分子物质必须结合高分子蛋白质后才能作免疫检测之用。竞争法按实验操作原理的不同又可分成直接竞争法和间接竞争法,研究者可根据自身的条件和实际要求,灵活地设计适当的ELISA法。另外还有捕获法测IgM抗体、ABS(avidinbiotinsystem)-ELISA法以及PCR-ELISA法和斑点免疫酶结合试验等检测方法[5]。3ELISA技术在食品检测中的应用现状近年来，ELISA因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性，在农药残留、动物违禁药物残留、有害细菌、有机物重金属污染、生物毒素、有害添加剂以及病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域正逐步推广应用。3.1毒素检测真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，有十几种对人类危害较大，它们具有毒性强和污染频率高的特点。目前利用合成单克隆抗体的方式，几乎所有重要真菌毒素如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素、黄曲霉毒素（AFT）等的ELISA检测方法均已建立。另外该方法也正在被广泛地应用于各种藻类和贝类毒素的检测。不过目前国内研究的最多的是黄曲霉毒素，王彩云等分别采用黄曲霉毒素M1测定试剂盒（德国必发）货号R1101和黄曲霉毒素B1测定试剂盒（德国必发）货号R1211测定了奶粉中的黄曲霉毒素M1和食品配料中的黄曲霉毒素B1。柳洁等对粮油中的黄曲霉毒素B1用了AFLA酶联免疫筛查试剂盒(美国InternationalDiagnosticSystems公司)进行测定，并与高效液相色谱法（HPLC）进行比较，结果差距甚微。可以看出，ELISA技术在黄曲霉毒素的研究方面较为成熟，但是其测定的试剂盒也多为进口，国内自主研发的甚少，所以我们需要在自主研发领域多下功夫，掌握核心竞争力才是硬道理[6]。3.2细菌污染检测目前利用ELSIA检测食品中的有害细菌数量有许多种途径，其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的酶联免疫测定技术研究最多，检测结果准确可靠。ELISA法可用于检测食品中沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌、李斯特菌及金黄色葡萄球菌等致病微生物。另外，ELISA在寄生虫的检测中也有应用，如：猪弓形虫[2]。3.3农药残留检测酶联免疫测定已成为许多国际权威分析机构如AOAC分析农药残留的首选方法。迄今为止，应用酶联免疫测定检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。例如草甘膦的ELISA检出下限为0.07μg/mL，与色谱法测定的结果一致[5,6]。3.4肉类品质检测ELISA在肉类食品品质检测中的应用主要包括加热终温判定分析和掺入异种肉的检测两个方面。利用蛋白质制备抗体，可以指示蛋白质在加热过程中变化，在商业上作为快速判定分析肉品终温的一种ELISA方法。对掺入异种肉的检测，则利用单克隆抗体的酶联免疫测定法。目前在商业上，酶联免疫测定已可以检测十多种动物肉[2,6]。3.5动物违禁药物残留残留检测目前几乎所有违禁药物均已建立了ELISA检测方法，如：β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、磺胺类、呋喃唑酮AOZ和氟喹诺酮类等，尤其是盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等违禁药物[7,8]。例如瘦肉精（盐酸克伦特罗）酶联免疫检测法，基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，不仅可作为一个定性筛选过程，也可以进一步进行定量测定。另外，宠物食品及含油食品中氟喹诺酮类药物如诺氟沙星、环丙沙星等残留也可以利用该方法检出，且满足欧盟及日本美国等地区和国家对该类药物筛选检测的要求[7]。3.6转基因成分检测ELISA法可以检测某些特定的转基因表达蛋白，以分析食品是否来自转基因生物或含有转基因成分。美国食品药品管理局（FDA）已研究出用双夹心ELISA法检测食品中是否含有转基因玉米成分。StratejicDignostics公司已开发利用ELISA原理的试剂盒用于检测转基因大豆。EnvirologixELISA试剂盒可用于测定玉米中的Cry9C蛋白。Lipp等使用ELISA法，通过抗体特异性地与CP4-EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，来源于农杆菌CP4)蛋白结合，检测RRS(rundupreadysoybean，抗革甘膦大豆)[2,5,6]。3.7病原体检测目前在禽流感病毒检测方面，我国已完成并建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已形成试剂盒生产能力。另外，采用ELISA法还可以有效检测牛及羊朊病毒蛋白，该蛋白可引起牛的病理性海绵状病毒，是一种致死性神经系统疾病（疯牛病，BSE），与人群发生变异型克雅氏病（VCJD）有关。3.8环境污染物的检测ELISA亦可用于检测环境污染物，如：重金属、二噁英和甾体激素等的检测。利用能与Hg、Cd、Pb、ZnCu、Ag等重金属离子结合的金属硫蛋白，设计的ELISA检测方法可以高效灵敏地检出食品中含有的以上几种重金属[5,6]。3.9其他成分的检测（1）食品中营养素的测定如:a检测婴幼儿配方食品中谷蛋白含量[9]b检测保健食品中透明质酸的含量[10]c牛初乳中乳铁蛋白含量[6]（2）抗营养素因子的检测如：大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子[2]（3）可用于检测食品加工过程中的酶含量的变化[5]如:磷酸丙糖异构酶(TIM)和转谷氨酰胺酶(TG)(4)有害食品包装材料的检测如：双酚A（BPA）[11]4ELISA技术的优点及不足与其他检测方法相比：目前用于食品安全检测的方法有很多，如薄层色谱(TLC)、微生物法、气相色谱（GC）、质谱（MS）、高效液相色谱（HPLC）和核酸探针技术等。TLC必须进行较为复杂的样品预处理和抽提，且不能定量，灵敏度低。微生物法不易筛选到特别敏感的菌株，也只能定性不能定量，易受其他抗菌药物的影响。GC及HPLC等虽灵敏度高，但设备昂贵，样品预处理复杂，检测费用高，难以推广使用，核酸探针则在实验过程中易受到污染。然而，食品安全检测的发展方向是快速、灵敏、简便。ELISA分析与其它方法相比，有以下优势：(1)高特异性；(2)高灵敏性，检测范围在ng和pg水平；(3)准确度高、重现性好；(4)一次性可处理大量样品，适宜于用定性试验进行筛选；(5)易于推广到基层。ELISA分析也存在着一些缺陷，比如：(1)不能同时分析多种成分；(2)对试剂的选择性高；(3)对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。但如果与其它检测手段联合使用，如GC、HPLC，既可增加检测的灵敏度又可降低交叉反应，还可进行更准确的定量。随着McAb技术的成熟，随着新ELISA法的不断出现，随着免疫试剂盒的商业化，ELISA分析在食品安全检测领域中一定会得到进一步的应用和推广。5结语当前我国在ELISA方面的研究还处于起步阶段，许多成分的检验都是模仿其他发达国家或者购买其试剂盒，自主创新的很少。因此，为了我国的食品安全，身在食品领域的我们任重而道远。参考文献[1]杨利国,胡少昶.酶免疫测定技术[M].南京,南京大学出版社,1998.[2]李玉珍,林亲录.酶联免疫吸附技术及其在食品