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绪论细胞工程(cellengineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。又称细胞技术，是生物技术的主要内容之一。生物技术是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。细胞工程的研究内容：细胞工程基本技术；细胞、组织、器官培养；原生质体培养；细胞融合及培养生物技术主要包括：细胞工程、基因工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程和生物化工程。细胞学说的提出：施旺，施莱登（1838年）1902年，Haberlandt提出了细胞全能性学说细胞工程分类（填空）:植物细胞工程和动物细胞工程1.细胞工程的应用：（一）、脱毒和快速繁殖许多植物，特别是无性繁殖植物，带有病毒，并直接传给子代，严重影响产量和质量。一般茎尖生长点不带病毒。所以，利用茎尖培养再生的植株，可能不带病毒，再进行大量繁殖生产脱毒苗。脱毒苗用于生产可明显提高产量、质量和商品价值。甘薯、马铃薯、草莓、果树、花卉等。（二）、细胞工程育种1.利用培养变异，筛选优良突变体植物离体培养，能够明显提高突变率，并且会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、植株形态、生育期、耐性等等。可以从中选择优良突变体，培育新品种。2、利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往往败育。此种情况下，可以将幼胚在败育前进行离体培养，以获得缘远杂种植株。3.利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。野生种往往有许多优良性状，但大部分野生种与栽培种杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应用。利用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性，获得体细胞杂种，使野生种的利用成为可能。（三）、离体种质保存随着地球不断开发、生态环境破坏，种质资源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养法，超低温保存（-196℃）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。（四）、细胞培养生产有用物质利用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、食品添加剂、酶、农药等2.细胞工程主要研究内容（1）动植物细胞与组织培养主要包括细胞培养、组织培养和器官培养。（2）细胞融合（3）染色体工程：按人们的需要来添加、削减或替换染色体的一种技术。主要用于新品种的培育。（4）胚胎工程：主要是对动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作获得人们所需要的成体动物，包括胚胎分割、胚胎融合、卵核称植、体外受精、胚胎培养、胚胎移植、性别鉴定、胚胎冷冻技术等。（5）细胞遗传工程：主要包括克隆和转基因技术。第一章实验室的设备及其基本操作技术第一节实验室的设备实验室设计最基本应该有三室：准备室、无菌操作室和培养室第二节培养基及其配制1.培养基的成分及作用2，一般培养基中的五类物质各有什么作用？1）无机营养成分，包括大量元素N，P，K，Ga，Mg，S和微量元素Fe,B,Mn,Cu,Co,Zn,Mo等;2）有机营养成分，常用有机成分：糖类（蔗糖），维生素，肌醇，腺嘌呤，氨基酸。主要采用的是蔗糖，提供处于异养状态的植物组织所需要的碳元素；3）维生素，主要使用的有B1,B6和B5,补充离体状态下细胞内生维生素的不足，提高细胞的活力；4）激素，包括生长素、分裂素、脱落酸、赤霉素和乙烯。激素：生长素（根），细胞分裂素（芽），赤霉素（细胞伸长）；5）其他添加物质，例如琼脂作为培养基固化剂、山梨醇作为渗透压调节剂、活性炭作为吸附剂等。4、蔗糖在培养基中有何作用？作为碳源为植物提供能源，为有机化合物的合成提供碳架，细胞内调节渗透压，对形态的发生的特殊作用等。11、培养基内加入活性炭的目的是什么？应注意什么问题？活性碳可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质、培养物分泌的酚和醌类物质、蔗糖在高在压消毒时产生的5-羟甲糖醛、激素等。2.植物激素5、生长素类物质大致可分为哪几类，目前植物组织培养中主要使用了哪些生长素，生长素在离体培养中有何作用？1.吲哚类，2.奈酸类，3.苯氧羧酸类。植物组织培养中生长素一方面用于诱导愈伤组织的形成和生根，另一方面是与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长以及某些植物胚状体的诱导。6、在植物组织培养中，细胞分裂素有何作用？在植物组织培养中细胞分裂素的主要功能是促进细胞的分裂和分化，打破顶端优势，诱导芽分化与增殖，促进组织和器官的不定芽发育。3.几种常用培养基基本培养基种类：MS,B5,N6,White(P26)（1）高盐平衡培养基：MS培养基、LS培养基、BL培养基、BM培养基和ER培养基。特点：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性；营养丰富；微量元素种类全，浓度高。（2）高硝态氮培养基：B5培养基，N6培养基及SH培养基等。特点：硝酸钾的含量高，氨态氮的含量低，含有较高的盐酸硫胺素。（3）中盐培养基：H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基和Blaydes培养基。特点：大量元素无机盐约为MS的一般，微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比MS多。（4）低盐培养基：White培养基、WS培养基、HE培养基、改良Nitsch培养基及HB培养基等。特点：无机盐含量低，有机成分含量相对也很低。4.培养基的配制1、生长素和细胞分裂素母液如何制备？生长素类(NAA、IBA等)先用1—2毫升95%酒精将其溶解,然后缓缓加入蒸馏水定容。细胞分裂素类(6—BA、KT等)先用少量(0.5—1当量浓度盐酸),然后缓缓加入蒸馏水定容,倒入瓶内,存于冰箱。如发现贮存后又产生沉淀,可加温使之溶解后再用。赤霉素需过滤灭菌。2、简述固体培养基的制备过程。将烧杯放入适量的水（终体积的3/4左右），按大量元素、微量元素、铁盐及有机成分的顺序，依次吸取各母液的需要量。2.按所需浓度加激素，或其它成分，如AgNO3等。3.加蔗糖，一般30g/L。4.定容5、pH值测定（5.8）。6.加琼脂，一般6-8g/L，溶化（电炉、微波炉等）。7.分注、封口（铝铂纸、牛皮纸、塑料纸等）。8.灭菌121℃，20分。第三节无菌操作技术维持实验室环境相对无菌应采取哪些措施？答：其灭菌方法是通过气体熏蒸和紫外线照射或其他方法。气体熏蒸：熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，可用每100ml甲醛加5g高锰酸钾为一个使用单位，具体的做法是在每20m2的范围内放置1个单位剂量。注意：为避免其气体对人体的危害并达到较好的消毒效果，一般熏蒸期间应将实验室封闭3~5d。以后在使用过程中，接种室还应定期熏蒸。紫外线照射：用紫外线灯照射0.5h，以保证接种室的无菌环境。其他：实验室每次使用前还可喷洒75%的酒精、过氧乙酸或2%的新洁而灭溶液进行接种室消毒。其他操作室的环境控制可根据情况选用紫外灯定期照射或其他方法污染的起因包括四个方面，1）植物材料表面灭菌不彻底或存在有内生菌；2）灭菌设备和无菌操作设备的异常；3）无菌操作技术不规范；4）培养条件不洁净第四节外植体的选择与处理外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。三种来源：1.生长在自然环境下的植物2.在温室控制环境条件下生长的植物3.无菌环境下培养的植物（最优）。1.外植体的选择1、选择优良的基因型实验首先应明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。2、取材从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，实验容易成功。3、外植体大小选择一般0.5-1cm为宜。因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，脱毒快繁，外植体宜小，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。4、选择外植体的时期外植体的生长动态往往与该物种的生长节律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养，会得到较好效果。（春天生长旺盛的植株，在春天培养会取得较好效果）二、外植体的处理1.取材母株的预处理人工管理，促使母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。2.外植体休眠的处理有些植物的种子、幼胚或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。3、外植体的灭菌大田或温室植物材料，都带有大量的细菌和真菌，这是组织培养的一大障碍，所以材料必须进行杀菌消毒（表面杀菌）。外植体消毒方法：取材后→将老的组织去掉→自来水冲洗→洗衣粉水洗（简单杀菌）→自来水冲洗→（超净工作台）70%酒精处理→消毒剂处理→灭菌蒸馏水冲洗3-5遍。消毒剂种类有很多，如次氯酸钠（效果应该比较好，无毒、无污染，见光氧化，影响杀菌效果）、升汞（效果应该比较好）、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。一般多用0.1%升汞。杀毒时间：一般酒精10秒，升汞5-12分钟。升汞处理方法：升汞+NaS→絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）→+FeSO4(中和过多的NaS)。第五节培养条件植物离体培养的环境条件及其对培养的影响：温度大多数在20-30℃之间，通常控制在25±2℃的恒温条件下培养；一般光照12-16h,光强1000-5000lux。；因此需要通风。一般培养容器使用棉塞、铝箔、专用盖等封口，容器内外空气是流通的。；湿度过高过低都不利于培养物生长。室内相对湿度70-80％。3、离体培养过程中人工光照的设置有何规律？在培养初期、对于大多数培养类型来讲只需要散射光或弱光照或黑暗条件下。当外植体细胞启动分裂后或进入分化培养阶段，则需要根据植物类型增强光照第二章细胞全能性第一节培养细胞展现生命特征属性1，植物细胞全能性的概念及其意义：植物细胞工程的基础理论是植物细胞的全能性理论，即每每个植物的体细胞或性细胞都具有该植物的全套遗基因，并在条件合适的情况下能够发挥该物种的各种功能和具有发育成为一个正常和完整的独立个体的能力。根据这一理论，组织培养技术通过创造各种合适的培养条件，促使细胞或组织发挥某一功能（例如合成药物）或生长发育成完整的个体以达到特定的某种目的（例如快速繁殖植物种苗）。2.生命特征属性：新陈代谢、应激性、自我复制细胞脱分化（celldedifferentiation）：（定义）培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。蛋白体的出现和细胞质密度增加被认为是细胞开始脱分化的标志。细胞分化（Differentiation）：（定义）是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。极性（polarity）：（定义）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。玻璃化：植物组织培养中分化出半透明的畸形试管植株（玻璃化苗）的现象，称为玻璃化现象。褐变：外植体在脱分化和再分化过程中，分泌褐色物质使培养基和外植体本身变褐的现象。分化细胞的脱分化需要两个条件：创伤和外源激素。简述植物细胞脱分化的过程启动阶段：蛋白体的出现和细胞质增生；演变阶段：细胞核移向中央、质体转化成原质体；脱分化终结期：回复到分生细胞状态，细胞开始分裂影响植物细胞脱分化和再分化的因子：主要包括内因和外因两个方面。内因主要指植物的遗传特性和生理状态。外因主要包括植物细胞营养条件（无机营养、有机营养、植物激素、天然提取物等）和环境条件（渗透压、酸碱度、温度、湿度、光照等）8、愈伤组织:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。实质上是一团无序生长的细胞，这些细胞大多处于随机分裂的状态。3.细胞分化和组织分化4.器官分化和植株形成器官发生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部长出根进而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上产生不定芽进而形成完整植株。3）在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。36、培养条件下，植物细胞经过再分化