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重庆医科大学2011级硕士研究生《蛋白质组学》试题姓名魏俊学号：2011120028所在大班：蛋白质组学5班专业：在职医学影像一、解释（共15分）1、MALDITOFMS（10分）答：即基质辅助激光解析离子化/飞行时间质谱，为近年来快速发展的一种新型软电离生物质谱，该仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。基质辅助激光解吸离子化是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法。该方法特别适用于对热敏感化合物或不挥发化合物的离子化。飞行时间质量分析器的离子分离是用非磁方式达到，离子在离子源中形成后被电场加速，进入真空无场漂移区，具有不同质荷比的离子因其通过漂移区的时间不同而实现分离。先后到达检测器产生信号。按照仪器构造不同，又可分为线性飞行时间质量分析器和反射飞行时间分析器。基质辅助激光解吸离子化/飞行时间质谱谱图中的主要信号是完整的分子离子峰，因此单电荷分子离子峰占主要地位，随着分析量增加，双电荷离子相对丰度增加，并出现多电荷离子。MALDI-TOF-MS的中心技术：依据样品的质荷比（m/z）的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。近年来已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技术之一，用于检测和坚定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、高聚物以及多种合成聚合物的强有力的工具。2、免疫共沉淀（5分）Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。二、问答题（共85分）1、WesternBlotting的流程（10分）。WesternBlotting实验流程第一步：蛋白样品制备蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液LysisBuffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于WesternBlotting、免疫共沉淀等后续研究。第二步：蛋白定量为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。第三步：电泳(1)SDS-PAGE凝胶配制沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30%Acr-Bis(29:1)（WB0014）；40%Acr-Bis(39:1)（WB0015）；PMSF(100mM)（WB0016）；0.5MTris-HCl,pH6.8（WB0017）；1.5MTris-HCl,pH8.8（W0018）。(2)样品处理每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。(3)上样与电泳第四步：转膜转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。也可以用沃尔森的丽春红染色液（WB0008，WB0009）对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，并用铅笔在膜上做出适当标记。还可以用沃尔森的蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒（WB0010）对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。第五步：封闭丽春红染色后可用铅笔在膜上做出适当标记，然后用预先准备好的WB洗涤液（WB0011）漂洗3～5min，将膜上的红色洗去。（注意：以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。）弃去洗液后，加入10%的脱脂奶粉（建议使用：完达山脱脂奶粉；奶粉可用WB洗涤液溶解），在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。如背景较高，可以在4℃封闭过夜。第六步：孵育1．一抗孵育参考一抗的说明书，按比例稀释一抗。在室温下孵育2小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。2．二抗孵育参考二抗的说明书，按比例稀释二抗。在室温下孵育1小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。第七步：显色建议选用Pierce公司生产的ECL发光液。第八步：显影ECL发光液处理过的膜，用保鲜袋包裹后，与X光片一起置于暗合中。根据荧光的强弱进行适当时间的曝光，取出X光片置于显影液，定影液中显影（WB0012）。2、血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题（10分）。1、血浆/血清样品选择①去血小板的血浆由于避免血小板的激活作用，减少了蛋白质的体外降解，因而较血清更适合一定的肽组学研究；②去血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品，更适合分析低分子质量的蛋白质；③如果要使用一定的蛋白酶抑制剂，一定要在早期加入，而且要谨慎使用，因为抑制剂的加入可能对MS分析造成一定的干扰，而且一些小分子的抑制剂与蛋白质结合转化成蛋白质的亚型，这些都将使得分析结果变得复杂。2、样品的收集与贮存①为减少血小板的污染，血液样品在分析前最好用0.2μm的低蛋白质结合膜过滤，样品分装冰冻储存，减少融化-再冰冻的循环；②样品应分装并贮存在液氮中，减少或不加蛋白酶抑制剂，以减少对测定结果的干扰。3、去除高丰度蛋白和分级技术血浆/血清样品中蛋白质种类很多，而且所含蛋白质具有较大的动力学范围，其中有许多丰度较高但不含有特殊生物学信息的蛋白质，这将会对目标蛋白质的分析造成极大的困难，甚至根本不能检测低丰度蛋白质，因此，通过对原始蛋白质进行洗脱和分步分离减少样品中蛋白质的复杂性，可以极大简化蛋白质的预测和分析，提高对低丰度蛋白质的检测和识别的灵敏度和准确度。4、多维策略的运用鸟枪测序法(Shotgunsequencing)，即高丰度蛋白去除+全蛋白酶解+二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱+反相色谱)分离+质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱)3、药物蛋白质组学定义及主要研究领域。试举例说明其在药物靶点的发现和确认中的应用（10分）。药物蛋白质组学就是蛋白质组学技术在药物研发中的应用。药物蛋白质组学的主要研究领域：临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。药物作用靶点的发现和确认：阐明药物的作用机制；药物毒理作用机制。耐药性及个体化治疗的研究；中药现代化中的研究应用药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用举例：（1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp27。（2）疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125-DCG-04打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—falcipain1；从数据库筛选到falcipain1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵红细胞。4、结构蛋白质组学与功能蛋白质组学的研究方法和内容的差异，以及在临床研究和应用上的特点与作用（10分）。结构蛋白质组学又称组成蛋白质组学，这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。*SWISS-PROT（1986）是专门的、含高度处理的七万多个蛋白质序列的数据库*另一相关数据库TrEMBL：含有从EMBL数据库内的核苷酸序列自动翻译过来的蛋白质序列蛋白质组学对复杂混合物的分析是在数据库及匹配工具帮助下进行部分序列测定，非通过完整序列测定来实现鉴定射线晶体学和核磁共振光谱学加强了蛋白质三维结构的研究，同时也产生structuralproteomics*“ProteinDataBank”是第一个蛋白质结构数据库，包含一万多个结构*结构蛋白质组学技术的发展：主要集中在增加结构测定的通量和启动整个蛋白质组结构分析系统计划功能蛋白质组学指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的全部蛋白质，即与某一功能相关的蛋白质，是总蛋白质组的一部分。例如：与某一生理现象或病理过程相关的所有蛋白质（比如炎症、肿瘤等）。它从局部入手，研究蛋白质组的各个功能亚群体，将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命、细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。界于对个别蛋白质的传统研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间。既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平）到细胞水平研究的重要桥梁环节。是一个相对较新的领域，涉及蛋白质相互作用、生物化学功能、细胞功能和系统功能等的研究研究方法蛋白质芯片、噬菌体展示技术、酵母双杂交。5、蛋白质组学在心血管基础和临床研究中的目的和意义（10分）。①从蛋白质水平研究相关心血管疾病的发病机制；②应用心血管疾病蛋白标记物来更早、更准确地检测心血管疾病，尤其是急性冠脉综合征(ACS)；③蛋白质组学来源的信息作为目前患者诊断的补充；④蛋白质组检测获得的信息有利于个体化治疗，为其提供新的治疗靶位；⑤蛋白质组学检测工具和信息用于治疗的各个阶段，可以适时评估治疗的效果和校正治疗方案。6、目前的蛋白质组学技术在医学研究中的优势和不足（10分）。答：蛋白质组学在疾病的研究中占有十分重要的地位，旨在运用蛋白质组学的研究手段，通过比较正常和病理情况下细胞、组织或体液中蛋白质在组成成分、表达水平、表达位置和修饰状态上的差异，寻找疾病诊断和预后的特异性蛋白质，包括特异性抗原及相关抗原、受体、酶等，以及药物治疗的靶标等。通过对疾病相关功能蛋白质进行定性、定量和表征研究，深入了解这些蛋白质的结构和功能，揭示疾病过程中细胞内全部蛋白质的活动规律，为疾病发生、发展机制的阐明和早期诊断及治疗提供理论依据和解决途径。蛋白质组学(proteomics)主要内容是以系统生物学的思路构建蛋白质组学技术策略与各种功能基因组学技术、临床试验诊断与治疗技术相结合的全新技术平台、在疾病的预防、早期诊断和治疗等方面推进基础医学与临床医学的结合，以期在人类重要疾病的预防方面取得重大突破。由于临床蛋白质促学具有广阔的应用前景而备受临床医疗机构、科研机构和药品研究与发展部门的高度关注。特别是临床蛋白质组研究计划，NIH医学研究指南以及HUPO三个国际合作项目的启动与实施，极大地推动临床蛋白质组学研究工作的快速发展，其研究对象是直接来自临床医学实践的实验样本材料。（1）临床蛋白质组学是将蛋