间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法1.间充质干细胞MSC基本形态2.干细胞应用与干细胞调控。3.间充质干细胞MSC生长过程4.间充质干细胞MSC培养的合适气体环境5.细胞培养板的选择6.如何选用细胞培养基7.如何维持培养液pH8.血清与干细胞的培养9.胎牛血清（FBS）是否需要灭活10.细胞的细菌、真菌污染及排除11.细胞培养污染的预防12.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么13.胶原酶的种类和选型14.胶原酶VS胰酶15.干细胞的种类和表面标记16.间质干细胞培养原理概述17.间质干细胞成脂和成骨诱导分化18.干细胞老化的表现和处理19.细胞传代消化过程指导20.冷冻保护剂作用和选择21.细胞冻存指导22.干细胞冷冻和复苏23.移植细胞的基因修饰1．间充质干细胞MSC基本形态体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。2．干细胞应用与干细胞调控干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。2.1内源性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。（1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。（2）转录因子的调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef是Wnt信号通路的中间介质，当与β-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。2.2外源性调控除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。（1）分泌因子间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt信号通路。比如TGF家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts的作用机制是通过阻止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。（2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch信号都起着非常重要的作用。当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。（3）整合素（Integrin）与细胞外基质整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。比如当β1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节β1整合素的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。2.3干细胞的可塑性越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强的可塑性。通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化（trans-differentiation）。关于横向分化的调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。3．间充质干细胞MSC生长过程潜伏期→指数增生期→停滞期（1）潜伏期(latentphase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形，然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束。细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。原代培养细胞潜伏期长，约24-96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24小时。（2）指数增生期(logarithmicgrowthphase)这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitoticindex,MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contactinhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piledup）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（DensityInhibition）。（3）停滞期(Stagnatephase)细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateauphase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。4．间充质干细胞MSC培养的合适气体环境干细胞相关的培养液都必须在5％CO2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。5．细胞培养板的选择细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底（U型和V型）；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536孔等；根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。（1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择不同形状的培养板有不同用途。培养细胞，通常是选用平底的，这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MTT等实验时，无论是贴壁和悬浮细胞，一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底的培养板。要特別注意材质，标示“TissueCulture(TC)Treated”是养细胞用的。U型或V型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养時，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用U型板，因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内內。圆底培养板还会用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等。V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用U型板替代（加入细胞后，低速离心)。（2）Terasaki板和普通细胞培养板的区别Terasakiplate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting和handingdrop两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystalclasspolymer，特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS材料，材料是treatedsufface，便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有lowbindingsurface（3）细胞培养板与酶标板的区别酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，需要更高的要求和特定的酶标工作液。（4）常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。常用的培养器皿培养器皿底面积（cm2）加培养液量（mL）可获细胞量96孔培养板0.320.110524孔培养板21.05×10512孔培养板4.52.01066孔培养板9.62.52.5×1064孔培养板285.07×1063.5cm培养皿83.02.0×1066cm培养皿215.05.2×1069cm培养皿4910.012.2×10610cm培养皿5510.013.7×10625cm塑料培养瓶255.05.2×10675cm塑料培养瓶7515~302×10725cm玻璃培养瓶194.03×106100cm玻璃培养瓶37.510.06×106250cm玻璃培养瓶7815.02×1072500cm旋转培养瓶700100~2502.5×108注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以293细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。6．如何选用细胞培养基培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。细胞培养基大致有：（1）合成培养基主要成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。常用的有：①199细胞培养基及其改良品种。1