重组质粒的构建转化筛选和鉴定

山东大学实验报告2012年11月26日姓名系年级学号科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一第1页共5页分子生物学实验报告一、实验目的1．学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。4.掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。二、实验原理外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子的鉴定。1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。）连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有山东大学实验报告2012年11月26日姓名系年级学号科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一第2页共5页分子生物学实验报告摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。3.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coliDH5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。三、实验仪器和材料试剂菌株：E.coliDH5α培养基：LB培养基、麦康凯培养基（加入AP）仪器：高速离心机，恒温震荡培养箱，恒温水浴锅，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，计时器试剂：TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，λDNA／HindⅢMarker，DL2000plusDNAPUC19质粒，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水山东大学实验报告2012年11月26日姓名系年级学号科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一第3页共5页分子生物学实验报告四、实验步骤1.载体与外源片段的酶切pUC19（自提）λDNA(comm)pUC19(comm)ddH2o13.5-12.566.037.510x/μbuffer2.010.05.0DNA3.0-4.015.05.0HindIII1.59.02.5Total20.010050.0混合均匀，上下摇晃4000转1min均分为两管，37℃水浴2hrs1h后，取一管，1%琼脂糖凝胶电泳，100v电压40min2.载体与外源片段的链接CompVol(μl)1ddH2O3.2210xT4连接酶Buffer1.03pUc19/III1.5-2.04λ/III3.5-3.05T4DNA连接酶0.8Total10.0混合均匀，上下摇晃4000转1min16℃保存3.感受态细胞的制备与转化E.coliDH5α感受态细胞的制备甘油管→LB平板（活化）→单菌落→LB平板（37℃o/n）→20mlLB(37℃o/n)→1%转接至新鲜LB液→37℃2-2.5hrs→冰浴10min→1.5mlx2，4000rpm/6000rpm5min→Votex+800mlCaCl2吹吸悬浮细胞→4000rpm5min吸弃上清→100μl0.1MCaCl2，轻悬，冰浴20min→感受态细胞4.质粒的转化及重组质粒的筛选分组\步骤c.cDNA冰浴热激冰浴复苏培养基涂布平板ligation麦+AP50μlx1I-test1005.05min42℃5minLB100μlx2-10min90s900150μlx2μl/tube200μlx2II-tranfControl50pUc190.537℃1h麦+AP50μlx1III-c.c50麦+AP50μlx1Control麦50μlx1预留一个麦+AP平板静置10min，于37℃倒置培养16-20hrs5.重组质粒的提取及电泳检测鉴定I中的平板→白色单菌落（无菌牙签）→接入预留麦+AP平板→4-6个菌落/组→37℃倒置o/n山东大学实验报告2012年11月26日姓名系年级学号科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一第4页共5页分子生物学实验报告五、实验结果pUC19和λDNA经HindIII单酶切作用结果的电泳检测电泳结果表明：λDNA分子量2万3bppUC19商业和测试酶切完全，分子量在2300+，经查的2686bp1~9组提质粒结果均出现两条亮带，上面的是酶切切开的质粒，下面的为超螺旋结构，最下方模糊条带为RNA少量残留，表明RNA酶效果显著，但仍没完全除掉RNA，（通过对照组未加RNA酶很明显能看出）两条亮带上方混杂带可能是DNA染色体的残留在质粒转化与重组质粒筛选的过程中，第一次加于麦康凯培养基的AP（氨苄青霉素）效果失活，导致II号平板即生长白菌又生长红菌，筛选失败。后老师又重新做了一批加入新AP的实验证明ap抗生素失活。E.Z.N.A.TMPlasmidMiniprepKit试剂盒提取重组质粒的电泳检测山东大学实验报告2012年11月26日姓名系年级学号科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一第5页共5页分子生物学实验报告电泳结果表明：所有组质粒中均连接上了或大或小的片段（125bp，700左右bp，6000+bp）而且并没有出现一个泳道有多个条带的混杂情况，证明单菌落挑的成功，且提质粒时没有混杂。我组连接片段为125bp和6000+bp六、注意事项1.实验之前枪尖，PE管，移液器，牙签都应包好灭菌2.无论手提还是试剂盒提取质粒，应按顺序加入试剂，solutionII和III时不要间断，溶液在pe管中混合式应轻摇3.加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。且要把样品加到液面下，酶从-20℃冰箱中拿出后放在冰中待用，加酶时枪尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓慢吹吸几次，保证足够的酶量4.无菌操作时不能带一次性手套，避免烫伤，涂棒或接种环应蘸乙醇烧2-3次，接种时确保涂棒或接种环冷却在点样5.电泳缓冲液最好是现配现用，从50x稀释6.配胶时，琼脂糖在微波加热下要完全溶解（溶液中没有不溶物），加热时锥形瓶上封上称量纸尽量避免加热时水分的蒸发。盛放胶的梳子和槽应洗净擦干，加热琼脂糖应冷却片刻在倒入槽中，避免将梳子烫变形。7.上样时垂直点入孔中，缓慢推入点样液，避免气泡产生8.EB染色时戴两层手套，避免将EB溶液滴在身上和周围，看胶过后，凝胶应用手套包好扔入指定的垃圾桶，尽量不污染环境