重金属污染物的免疫学检测技术研究进展

生态环境2005,14(4):[e-mail]基金项目：广东省科技攻关项目（2003C20411）作者简介：江天久（1964－），男，副研究员，主要研究方向为环境科学。*通讯联系人，[e-mail]收稿日期：2005-01-31重金属污染物的免疫学检测技术研究进展江天久1,2*，牛涛11.暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632；2.华南师范大学生命科学技术学院，广东广州510631摘要：重金属的免疫学检测是一种新型的重金属检测方法，与传统检测方法相比，具有省时、省力、费用低廉、便于携带、易于操作等优点，能用于重金属污染物的现场快速检测和常规检测，这对于重金属污染地区的补救和恢复工作具有很大的意义，因而发展和普及应用潜力很大。国外学者通过选择或合成双功能鳌合剂鳌合重金属离子并与载体蛋白偶联制备出完全抗原，进一步制备出金属特异性单抗。目前应用免疫学检测方法检测环境中的重金属离子还处于实验室的试验阶段，初步实验结果表明KinExA免疫检测法具有用作重金属免疫检测传感器的能力，并且越来越多的重金属检测模型被开发出来。金属特异性抗体-抗原的结合属性的初步研究表明，影响抗体对抗原识别的主要因素有：金属离子的半径、电子和形态上的并协性；鳌合剂的结构；金属离子-鳌合剂复合物三维结构和价态结构；抗体中的某些氨基酸残基能与抗原中金属离子直接配位以及与抗原中的鳌合剂部分发生相互作用（疏水作用、氢键作用等）。关键词：重金属污染；免疫学检测；单克隆抗体；鳌合剂中图分类号：X55文献标识码：A文章编号：1672-2175（2005）04-0590-06现已知至少20种左右的重金属有很大的毒性，它们中又有一半以上被大量释放到环境中，对人类健康造成严重威胁。目前常用的重金属检测方法为石墨炉原子吸收光谱法、ICP-AES、X射线荧光光谱法等，这些检测方法虽然能精确测量样品中单种金属的总量，但检测相对费力、费时、费用昂贵,需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不能用于现场检测。此外，这些检测方法不能提供重金属的氧化状态或者演变信息。由于上述缺点的限制，检测的样品数一般会少于最佳检测数量，导致在随后进行的重金属污染程度和风险的评估工作存在较大的不确定性[1]。重金属免疫学检测方法的建立为这类污染物的检测提供了另一种途径。该方法具有检测速度较快、费用低廉、简单易携、高度的灵敏度和选择性的特点[1~4]。这种方法理论上能应用于能产生合适抗体的任何污染物质。自从Reardan等人首次通过金属-鳌合剂抗原产生并分离出单克隆抗体以来[5]，国外越来越多的抗Hg2+、In3+、Cd2+、Pb2+、U6+等金属-鳌合剂复合物抗体被研制出来[1,6~12]。本文综述了关于金属特异性单克隆抗体的制备、免疫学检测方法的建立以及抗体-抗原的结合属性的研究进展。1重金属抗原及其特异性单抗的制备制备重金属特异性单抗的关键点在于金属抗原的制备。重金属离子自身不能作为有效的抗体识别目标，因为它们带有电荷，趋向于与生物分子发生强烈的不可逆的反应（这也是重金属的毒性所在），因此用鳌合剂与金属离子配位使之与生物分子的反应能力减弱，这种金属-鳌合剂复合物应能够提供一个能被免疫系统识别的有机物外壳[10]。应用此理论在制备重金属特异性单抗时发现重金属-鳌合剂复合物是低分子量的半抗原，不足以引起小鼠免疫反应的发生，后来选用结构较复杂的大分子双功能鳌合剂，一方面鳌合重金属，另一方面通过其上的硫氰基团将其偶联到载体蛋白（BSA或KLH）上，从而制备出完全抗原[1,6~12]。制备金属特异性单抗可以通过筛选或合成鳌合剂、抗原制备、小鼠免疫、细胞融和、杂交瘤筛选、抗体纯化、抗体结合属性分析等步骤完成。2重金属竞争性免疫检测方法2.1重金属间接竞争ELISA免疫检测法重金属间接竞争ELISA免疫检测法是通过样品中的重金属离子与过量鳌合剂形成溶解性的金属-鳌合剂复合物抗原（溶解性抗原）与已经包被在酶标板上的金属-鳌合剂-蛋白质复合物抗原（固化抗原）竞争抗体的抗原结合位点，添加酶标二抗和显色物质产生荧光信号，与标准曲线对照得出样品中的重金属离子浓度[1,3,10]。2.2重金属KinExA免疫检测方法KinExA是一种计算机控制的流式荧光计，用来进行自由抗体、自由抗原和抗体-抗原复合物的快江天久等：重金属污染物的免疫学检测技术研究进展591速分离和定量检测[13]。KinExA由毛细管流/观察单元组成并配有多微孔筛，各种被测液能在负压下通过筛孔。统一大小的小珠堆积在筛子上形成了一个填充床，其表面包被固化抗原。与间接竞争ELISA法一样，样品中的重金属离子先与过量鳌合剂鳌合形成溶解性抗原，加入抗体并使抗体和溶解性抗原之间的结合达到平衡，然后这种溶液快速流过包被有固化抗原的小珠，这时还具有抗原结合位点抗体被小珠捕获，用缓冲液冲洗，加入酶标二抗和显色剂显色，通过PC界面来检测和记录荧光信号，与标准曲线对照得出金属离子浓度[14,15]。Blake等人分别用KinExA法和间接竞争ELISA法对样品中的Cd2＋、Co2＋、U6+、Pb2＋离子进行检测[1]。结果显示KinExA法检测这些金属的灵敏度和精度都远远优于间接竞争ELISA法。其原因可能在于[1,10]：（1）包被固化抗原的小珠具有较大的表面积；（2）检测液以较高的流速通过小珠，这样能降低其在反应界面的扩散；（3）抗体与固化抗原接触时间有限（250~400ms），这样能减少抗体重复结合到固化抗原上；（4）抗体对溶解性抗原和固化抗原的结合力不同。初步试验表明KinExA3000具有用作环境样品重金属离子免疫检测传感器的能力，后来Blake等人用它研制出检测Cd2+离子的免疫传感器模型，它能精确地测量适度复杂样品矩阵，达到与ICP-AES可比的检测水平[1]。目前应用KinExA仪器对重金属离子进行检测只是在实验室中进行，Blake等人正与Sapidyne仪器公司和KinExA制造商进行合作使这种仪器小型化并能应用于现场检测[3]。2.3一步竞争性重金属免疫检测法在间接ELISA法检测的基础上，Darwish等人采用一步竞争性免疫检测法（直接竞争ELISA法）对水样中的Cd2+离子进行检测[4]。其基本原理是把检测抗体包被在酶标板内，样品中的金属离子先与过量鳌合剂混合形成金属离子-鳌合剂复合物，并与已知浓度的金属离子-鳌合剂-酶复合物混合，二者在包被有抗体的微孔中竞争抗体的抗原结合位点，冲洗后加底物显色，与标准曲线对照得出金属离子浓度。这种方法与间接竞争ELISA法不同之处在于：（1）包被在微孔板内的前者是抗体，后者为金属-鳌合剂-蛋白质复合物抗原；（2）样品中的金属离子形成金属-鳌合剂复合物后，前者是与金属-鳌合剂-酶复合物竞争检测抗体结合位点，从而不需要添加酶标二抗（一步竞争法由此得出），后者是与金属-鳌合剂-蛋白质复合物竞争。Darwish等人研究表明，一步竞争性重金属免疫检测法比两步法（间接竞争ELISA法）灵敏、简便，并且其pH值在7.0~7.6范围内不产生抑制，优于两步法的PH值范围（7.0~7.2），这种相对较宽的pH工作范围减少了对检测样品的pH值限制，它对Cd2+离子的检测限能达到0.3×10-9，如此高的灵敏度能够对人类血清中Cd2+离子进行检测。随后Darwish等人用此法实现了对人类血清中的Cd2+离子进行检测，检测范围在0.24~100μg/L（变异系数≤10%），其检测结果与石墨炉原子吸收光谱法有较高的相关度（r＝0.984）[16]。2.4荧光偏振重金属免疫检测荧光偏振重金属免疫检测法（FPIA）是不同于ELISA法的荧光标记免疫检测方法，其原理为样品中的金属离子与过量鳌合剂形成金属-鳌合剂复合物后，与固定浓度的金属-鳌合剂荧光复合物竞争检测抗体上的结合位点，然后进入荧光偏振分析仪进行分析，通过与标准曲线对照得出金属离子的浓度。Elbaum等人用酶间接荧光偏振法检测Zn2+离子，并提出这种方法用在现场测试时非常有效[17]。Johnson等人用FPIA法对土壤、固体废物渗滤液、空气尘埃、饮用水中的Pb2+离子进行检测，试验结果表明土壤样品的检测结果与ICP-ACE的检测结果的相关系数（r2）高达0.96，其检测限可达1×10-9左右[9]。后来Johnson又用此法对环境中的Pb2+和Cd2+离子进行检测，二者的检测限分别为20×10-12和低于100×10-12[10]。3金属特异性抗体-抗原结合属性初步研究金属离子-鳌合剂复合物能提供一个独特的、能被抗体识别的结构，改变、更换金属离子或者鳌合剂都能使该结构发生改变，但金属离子的更换使该结构的改变较小，而鳌合剂的改变或更换则可使之有较大的改变[11]，从而影响抗体对金属离子-鳌合剂复合物的亲合力和识别能力。另外，金属特异性抗体中的部分氨基酸在识别抗原中起了非常重要的作用。3.1金属离子-鳌合剂复合物中的金属离子对抗体亲合力的影响Boden等人对mAb734（抗DTPA-In3+复合物抗体）的结合属性的研究发现：此抗体对DTPA-Fe3+、-Fe2+、-Cu2+、-Mg2+、-Ca2+、-Zn2+的亲合力比DTPA-In3+少了两个数量级，他们对这些金属在元素周期表中的位置和它们的电子轨道进行比较，认为mAb734对其他金属亲合力减少的原因可能是这些金属离子的电子的和形态的并协性（complementarity）的不同引起的[18]。另外，Blake等人对CHA255抗体和2A81G5抗体的结合属性进行比较分析得出，CHA255抗体的KD值不与金属离子半径或者金属离子-鳌合剂的稳定常数相关，而592生态环境第14卷第4期（2005年7月）2A81G5抗体对金属离子特异性和结合力与二价金属原子大小有较好的相关性（Hg2+和Mg2+除外）[8]。3.2鳌合剂的结构在抗体识别抗原中的作用3.2.1鳌合剂一级化学结构对抗体亲合力的影响Khosraviani等人对鳌合剂DTPA、EDTA及其衍生物与2C12抗体的结合属性进行研究发现：2C12抗体对DTPA和EDTA亲合力最低，增加一个p-硝基苯基到二者上可使其与抗体的亲和力分别增加30倍和5.7倍；增加一个环己基效果更加显著：抗体对CHXDTPA和CHXEDTA的亲合力分别为DTPA和EDTA的9100倍和160倍[19]。鳌合剂的结构不但影响抗体与鳌合剂的亲合力，而且影响抗体与金属-鳌合剂复合物的亲合力。Blake等人用抗体2A81G5、2C12、15B4、8A11研究鳌合剂结构对抗体与金属-鳌合剂复合物结合力的影响[1]。结果发现：由于制备2A81G5、2C12、15B4抗体的原抗原中的金属-鳌合剂部分都通过硫脲基-L-苯基与蛋白质KLH联接，造成这些抗体偏向于结合含苯基、硫脲基-L-苯基的鳌合剂-金属复合物。例如，2A81G5抗体与Cd2+-EDTA复合物的Kd值为21nM，当在EDTA上增加一个p-硝基苯基则其Kd值降为5.6×10-10M，当Cd2+-EDTA-苯分子通过硫脲基偶联到BSA上时其Kd值降低到了7.2×10-11M[8]。2C12抗体结合Pb2+-DTPA-硫脲基-L-苯基-BSA的亲合力比Pb2+-DTPA复合物增加了300倍，当用CHXDTPA替代Pb2+-DTPA复合物中的DTPA后，2C12抗体对其亲合力增加了将近1000倍[19]。抗体15B4也有类似的性能[1]。CHA255抗体对p-硝基苯-EDTA-In3+的亲合力比EDTA-In3+大了10倍左右[5,20]。而抗体8A11的原抗原为KLH-硫脲基-DCP-U6+，这种抗原中的鳌合剂并没有通过一个体积较大的苯基使其与蛋白质偶联在一起，这样蛋白质-硫脲基-DCP-U6+复合物抗原与溶解性的DCP-U6+复合物抗原在结构上比较类似，使抗体8A11对二者亲合力的差别