野生干蕨菜对亚硝酸盐清除作用研究实验方案

野生干蕨菜对亚硝酸盐清除作用研究实验方案2.实验方案2.1.仪器分光光度计、电子天平、粉碎机、比色皿、移液管、烧杯、棕色容量瓶、三角瓶、恒温水浴锅、精密pH值试纸2.2．试剂对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸、氨水均为分析纯，蒸馏水。对氨基苯磺酸溶液（0.4%）：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存；盐酸萘乙二胺溶液（0.2%）：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存；亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于200μg的亚硝酸钠；亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00ml，置于200ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠；O.5mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液（pH=3.0）：取0.1mol/L柠檬酸18.6ml（21.01gm/l），0.1mol/L柠檬酸钠1.4ml（29.41g/ml）加蒸馏水定容至100ml。盐酸（0.1mol/l）：量取5ml盐酸（35%-37%），用水稀释至600ml。25%氨水；2.3.原料野生干蕨菜。2.4．实验方法2.4．1.样品的制备将干蕨菜粉碎，称取7份5g蕨菜粉，分别加入7个三角瓶中，各加入30ml蒸馏水，在不同条件（温度、时间、配比，pH值）下提取，然后用4000r/min转速离心10min，取上清液备用。2.4．2.最大吸收波长的确定准确吸取5μg/ml硝酸钠标准液7ml置于25ml容量瓶中，加入0.4%对氨基苯磺酸1.0mL，摇匀，静置4min，加入0.5mL0.2%盐酸萘乙二胺，加水定容至刻度,摇匀，静置15min。另以蒸馏水代替亚硝酸钠，用同样配制方法的溶液作为空白（即参比溶液），做光谱扫描,测定最大吸收波长。2.4．3.标准曲线的绘制分别吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL亚硝酸钠标准使用液分别置于25ml容量瓶中，加入0.4%对氨基苯磺酸1.0mL，摇匀,静置4min，加入0.5mL0.2%盐酸萘乙二胺，加蒸馏水定容至刻度,摇匀，静置15min于最大波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，另以蒸馏水代替亚硝酸钠，用同样配制方法的溶液作为空白（即参比溶液）。（R=0.999）2.4．4.样品提取液对亚硝酸盐的清除能力的测定准确吸取5μg/mLNaNO27mL，置于25mL容量瓶中，加入5mL蕨菜提取液，反应10min，然后加入0.4%对氨基苯磺酸1mL，摇匀，静置4min,再加入0.2%盐酸萘乙二胺0.5mL，摇匀加水定容至25mL，静置15min，用2cm比色皿于最大吸收波长处测定吸光度A1；以蒸馏水代替提取液做空白，测得吸光度A2。按下式计算蕨菜提取液对亚硝酸盐的清除率。清除率（%）=（A2-A1）/A2×100%A1—加蕨菜汁提取液测得值；A2—未加蕨菜汁提取液测得值。2.4．5.浸提温度对清除亚硝酸盐的影响试验取在不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）水浴下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色，测得在最大吸收波长处的吸光值，试验重复三次，计算清除率。表1不同提取温度对亚硝酸盐的清除率温度（℃）A1(n=3)A2(n=3)清除率（%）20（室温）3040506070802.4．6.蕨菜汁提取液与亚硝酸盐提取时间试验取在不同提取时间（0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min）下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色，测得在最大吸收波长处的吸光值，试验重复三次，计算清除率。表2不同提取时间对亚硝酸盐的清除率时间（min）A1(n=3)A2(n=3)清除率（%）03060901201501802.4．7.蕨菜汁用量对亚硝酸盐清除率的影响试验取在不同提取配比下的提取液（0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml）7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色，测得在最大吸收波长处的吸光值，试验重复三次，计算清除率。表3不同提取用量对亚硝酸盐的清除率用量（ml）A1(n=3)A2(n=3)清除率（%）01234562.4．8.不同pH值对亚硝酸盐清除试验取在不同提取pH值（1、2、3、4、5、6、7）下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中，均加入5μg/mlNaNO27ml，在室温下反应10min，均加入对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺定容、显色，测得在最大吸收波长处的吸光值，试验重复三次，计算清除率。表4不同提取pH对亚硝酸盐的清除率pHA1(n=3)A2(n=3)清除率（%）12345672.4.9.最佳清除条以提取温度、提取时间、提取液用量、提取PH值,做L9（34）正交试验，确定最佳清除条件。表5L9(34)正交试验结果分析试验号ABCD清除率%111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3K1K2K3R2.5.模拟胃液条件下亚硝酸盐NaNO2消除反应取O.5mol／L柠檬酸钠-HC1缓冲液(pH=3)5.0ml，准确吸取5μg/ml硝酸钠标准液7ml置于25ml容量瓶中，加入0.4%对氨基苯磺酸1.0mL，摇匀静置4min，加入0.5mL0.2%盐酸萘乙二胺，加水定容至刻度,摇匀，静置90min，测吸光度值，试验重复三次。