金属硫蛋白(MT)在农业动物养殖业中的应用研究进展

金属硫蛋白（MT）在农业动物养殖业中的应用研究进展薛元勋，孙建华，王慧*(山东省山东农业大学动物科技学院，山东，泰安，271018)摘要：金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于生物中的低分子量、富含金属和半胱氨酸，且能被金属或其它因素诱导生成的金属结合蛋白。是一种具有天然生物活性的物质，具有广泛的生物学功能，其主要作用是：参与微量元素的储存、运输和代谢，重金属解毒，清理自由基，拮抗电离辐射，增强机体的免疫力和抗应激等，参与DNA的复制、转录和能量代谢的调节过程。因此，MT对提高动物的抗应激能力和健康生长，以及提高畜产品的质量等都具有重要意义。另外，MT还可作为模型系统，应用于基因表达调控和基因工程研究领域。本文综述了MT的结构、代谢特点、生物学功能和在养殖业中的应用，启示金属硫蛋白在养殖业中具有诱人的应用前景；MT在临床、重金属中毒与环境监测、临床应用和功能食品等方面也将有广阔的应用前景。关键词：金属硫蛋白；养殖业；抗应激；诱导生成；应用前景金属硫蛋白(Metallothionein，MT)也称为金属硫氨酸甲基内盐，在正常生理条件下，金属硫蛋白主要是Zn或Zn、Cu结合蛋白，主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰脏和小肠中，是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异蛋白质。1957年哈佛大学的Margoshes和Valee等在研究马肾脏蓄积镉的过程中首次发现并分离出MT，此后，在真核微生物、高等植物、原核生物等均发现有MT存在并能被分离出来。在1997年的第四届国际MT会议上，被发现并确定氨基酸序列的MT共有170多种。MT是一种具有天然生物活性的物质，具有广泛的生物学功能，涉及生物有机体的生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激等各个方面。其主要作用是：参与动物体内微量元素的储存、运输和代谢，解除重金属的毒性，清理体内自由基，拮抗电离辐射，增强机体的免疫力和抗应激能力，参与DNA的复制、转录和能量代谢的调节过程。因此，MT在提高动物的抗应激能力、健康生长和提高畜产品的质量等方面具有十分重要的作用。近年来，对MT的研究和应用已经涉及到农业、医药、保健、生物工程、环境保护等诸多领域。MT的重要作用和应用价值逐步被重视，这为防治心血管疾病、遗传性疾病、风湿及类风湿疾病、抗肿瘤和抗衰老研究提供了新的途径。对MT抗氧化和抗应激方面的研究尤其显示出了开发和利用金属硫蛋白的诱人前景。1．金属硫蛋白的结构特征金属硫蛋白（MT）的化学名称为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一种小分子的金属结合蛋白质。一般而言，哺乳动物的MT的相对分子质量为6000～7000道尔顿，去金属后的硫蛋白(thionein)的相对分子质量为6000道尔顿左右。其多肽链一般含有61～62个氨基酸残基，其中半胱氨酸（Cys）含量较高，有20个之多；有6～8个Lys，7～10个Ser，但不含芳香族氨基酸。哺乳动物中存在4种MT异构体，即MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。其中MT-Ⅰ和MT-Ⅱ，存在于各种器官中；而MT-Ⅲ在脑组织中；MT-Ⅳ仅发现在鳞状上皮组织中。诱导后，肝MT-Ⅰ和MT-Ⅱ主要结合锌，肾MT-Ⅰ和MT-Ⅱ主要结合镉、铜或锌；MT-Ⅲ和MT-Ⅳ主要结合锌和铜。MT的氨基酸序列高度保守，“Cys—X—Cys”三肽序列是所有MT的特征序列。MT结合金属的能力较强，一般含有4～12个金属，通过硫酯键与蛋白质结合并具有特征光谱，MT结合各种金属的能力顺序由高到低依此为：Hg(II)Ag(I)Cu(I)Cd(II)Zn(II)。MT中的金属可以被脱去，脱去金属的硫蛋白在低pH值时较稳定。MT中的Zn在pH3.5～4.5时能迅速释出，Cd在pH2.5～3.5时释出；而Cu在酸性条件下则形成Cu的不溶性聚合MT。因此，MT的存在形式及其稳定性与它是否结合了金属、所结合金属的种类以及环境的酸碱度（pH）密切相关。2．MT的可诱导合成特性MT的合成具有高度的可诱导性，可被多种因素诱导。李丽立等的实验表明，高剂量的锌能诱导MT在杜长大三元杂交猪肝脏内大量合成，最佳累计锌诱导剂量为330mg／kg。在对家兔的诱导实验中也得到了相似的结果，诱导后兔肉、血浆、肝、肾、肺和小肠中的MT含量与对照组比较均有显著的提高(P0.05)。张建鹏等和柴春彦等的研究表明，同一剂量下锌诱导MT合成效果比铁和铜诱导MT合成效果好，比镉和银诱导MT合成效果差，但镉和银诱导合成的Cd-MT和Ag-MT结合比较牢固，其它金属不能置换Cd-MT和Ag-MT中的Cd和Ag，因而不能起到重金属解毒的功能。而锌诱导生成的Zn-MT能被多种金属置换，在重金属解毒方面起着重要作用；同时结合在MT中的Zn还能够行使其它生物学功能，因此,锌被公认为最安全、最有效的MT诱导剂。MT的合成也可通过激素(糖皮质激素、胰高血糖素和肾上腺素等)、细胞因子（白细胞介素-1等）和其它因素(如cAMP、干扰素等)诱导；各种生理应激因素（包括饥饿、高温、寒冷、精神紧张等）以及外伤因素（炎症因子和细菌内毒素等引起的组织损伤）均能使MT的合成增加。表明了MT在机体的应激反应过程中具有重要的生物学作用。另外，日粮中的半胱氨酸含量对MT的合成也具有明显的促进作用。李小龙采用同位素示踪法研究MT在猪体内的存留规律时发现：MT在猪体内能被消化道壁细胞完整地吸收，在各器官中存留浓度从大到小依次为：消化道皮肤肾脏肺脏心脏肝脏脾脏肌肉骨骼。3．MT的生理功能3.1MT对重金属的解毒作用MT具有很强的螯合各种金属离子的能力，与金属离子的代谢有重要关系。动物体可通过调节MT基因的mRNA合成来影响硫蛋白的合成，维持细胞内的Zn和Cu等金属离子处于低水平状态，防止过量的金属离子对膜系统、酶和细胞内其它敏感部位的毒害作用。MT是又一种金属离子缓冲剂，参与建立细胞内稳态动力学，使细胞内游离的金属离子的量保持在与正常细胞需要量相适应的水平。MT对重金属解毒作用的研究较多，特别是对镉的解毒作用。有研究表明，小剂量的Zn2＋、Cu2＋、Hg2＋和cd2＋诱导MT合成后，可降低高剂量镉中毒导致的死亡率。MT过量表达的转基因鼠对镉引起的死亡率明显下降，而MT基因剔除后则得出相反的结果。Park等通过研究敲除MT基因的小鼠发现，MT对一些金属解毒能力的顺序为CdZnCu≈AsHg，而对Pb和Fe则几乎无作用。MT的解毒机理可能为：减少进入细胞内的金属量，螯合进入细胞内的金属，而形成无活性的M-MT复合物和增加金属输出细胞。用重金属(Cd、Zn等)给予动物或处理体外培养的细胞，可增强MT基因的转录，从而使MT的合成速率增加，能防止Cu、Zn和Hg中毒。不过，MT并不是对所有能诱导它合成的金属都具有解毒作用，例如，Ag、Au、Co和Ni都能诱导MT的合成，但是MT并不对这些金属有解毒作用。同时，一些学者指出，虽然细胞内Cd2+-MT具有保护作用，但在胞外，Cd2+-MT具有比Cd2+本身更大的肾细胞毒性，所以，MT对重金属是否有解毒作用还存在争议，尚需深入研究。3.2MT参与动物体内微量元素的代谢MT能调节小肠对Cu和Zn等金属的吸收。小肠中MT的水平与Zn、Cu的吸收呈平衡关系。通过转基因鼠和细胞培养试验发现：MT直接参与锌的储存、运输及其生物利用。剔除MT基因的小鼠对锌的吸收能力降低，表明MT基因剔除后破坏了体内锌的平衡。可见，一方面，MT可通过生成含Zn的硫蛋白，保护细胞免受高水平锌的伤害；另一方面，可通过生成短暂的硫蛋白形式，提供细胞吸收锌的驱动力。MT通过与另一种富含-SH的肠道细胞蛋白（cysteinerichintestinaprotein，CRIP）的共同作用来调节Zn的吸收。当日粮中富含Zn时，MT水平升高，Zn与CRIP的结合减弱，以降低Zn的吸收；相反，缺Zn时，MT水平降低，Zn与CRIP的结合加强，以促进Zn的吸收。MT与Zn向肠腔的排泄有关，Zn-MT可能在肠牯膜细胞脱落前被降解或排泄出细胞，所释放的Zn可被吸收利用。补Zn的动物对Cu的吸收减少，可能是由于Zn诱导了肠MT的合成，而MT和Cu结合能力强于与Zn的结合能力，减少Cu跨基底膜内褶向血浆运转，因此，Cu-MT可随粘膜细胞脱落到肠道内而排出于粪便中。MT通过参与Cu和Fe的代谢来调节其它重要元素的代谢。Cu缺乏能改变奶牛肝脏中金属硫蛋白的代谢。当Cu缺乏时，动物肠道粘膜上Fe的转运受到抑制，沉积的Fe能诱导粘膜细胞合成MT，从而阻止其他重要元素（如Cu、Zn、Mn、Fe等）的吸收。3.3MT能够清除体内的自由基，提高动物的免疫力MT能够清除自由基、抑制脂质过氧化过程而保护细胞膜免于突变，增强吞噬细胞的功能，从而提高动物体的免疫力。体内正常情况下的氧化还原反应和肝损伤、炎症等病理条件下均可产生各种类型的含氧自由基。这些自由基除了参与细胞内重要的化学反应过程外，还可损伤生物活性分子如蛋白质和DNA，从而导致癌症、肝脏损伤、自身免疫性疾病以及衰老等。机体内存在一系列的抗氧化物酶系(如SOD等)和巯基化合物等，MT与它们协同作用，可使体内积累的过量自由基转变为无害的氧气和水。Thonalley等实验表明，MT具有强大的消除自由基的能力，是有效的细胞保护剂。MT捕获OH-的能力是GSH的100倍，而捕获氧自由基的能力是GSH的25倍；虽然MT对氧自由基的捕获能力不及SOD，但SOD只能清除氧自由基，不能清除OH－。可见，MT在清除自由基方面的作用更广泛。MT在清除自由基时可释放出微量元素Zn，促进使免疫功能和细胞代谢，从而提高其抗炎和自我保护、修复和自我改善的能力。MT对OH－引起的DNA损伤也具有一定的保护作用。MT的抗氧化作用机制的研究结果不太一致。Thornalley等据MT与OH一反应速率较高的事实认为，MT主要是通过其分子中半胱氨酸残基上的一SH和自由基的相互作用来发生抗氧化作用的。另一些学者则认为，硫蛋白本身的受氧化过程不是抗氧化的主要机制，起主要作用的可能是MT被氧化后释放的金属离子。有学者还发现，MT在氧化时也可将氢原子供给附近被自由基作用过的部位，使这些部位恢复到末损伤状态。或在释放出原子的金属离子后再和Fe等金属离子结合，使这些金属离子不易参与特定反应如Fenton型反应的形式，从而阻止H2O2向OH-的转变，抑制了脂质过氧化。3.4MT能够增强动物的抗应激能力通过MT增强机体的应激能力以及应激保护作用研究发现，冷、热、禁食、饥饿等应激都可诱导MT的合成，同时循环中的激素水平均上升。Beattie等的研究表明：寒冷应激可诱导产热棕色脂肪组织中MT-Ⅰ大量表达，且还发现敲除MT基因后的小鼠显示一定程度的肥胖。有报道说，饥饿应激状态下，Leptin有诱导MT合成的作用。大鼠在禁食24h和48h后，肝MT和过氧化物阴离子产物较对照组均显著增加。组织创伤和细菌感染同样也可以引起MT含量的增加，大鼠创伤后6h，肝MT含量较对照组增加6倍，创伤后24h降至正常水平。Brady推测应激因素诱导肝脏MT合成可能是肝脏再生锌的结果。此外，体力限制、剧烈运动、过度疲劳等同样也可以使MT的含量发生相应的变化。实验证明经口或腹腔内注射Cd时，动物的肝脏、肾脏、脾脏、肠等器官内MT含量增加，MT含量在给Cd后6-10h达高峰，MT的浓度随Cd的供给量的增加而增大，有时可达到40倍。Richards等人经大鼠腹腔注射Zn后证实，Zn可诱导肝与肠内合成MT，4h后MT开始增多，12～18h内含量最多，但诱导能力的强弱有所不同，Cd和Hg诱导MT的能力较强，而Zn较弱。此外，一些氧化剂、干扰素以及在炎症过程中形成的急性蛋白、钙信号等对MT在应激中的诱导都有一定的影响。4．金属硫蛋白在养殖业中的应用4.1MT可以减少仔猪腹泻，提高仔猪生长速度Hahn发现在断奶仔猪饲粮中添加3000mg／kg氧化锌，对减少仔猪腹泻，提高仔猪生长速度有显著效果，随后的大量应用试验也验证了这一结论。MT作为动物机体内的“锌池”，自然也成为高锌作用机理研究中的一大热点。如：高锌日粮可使鸡肝Zn和Z