项目一 动物组织中核酸的提取与鉴定

动物组织中核酸的提取与鉴定项目一一、实验目的•学习和掌握用盐溶法从动物组织提取核酸的原理和操作技术。•了解定性鉴定核酸的原理和方法。二、实验原理•根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。三、实验材料•试剂–地衣酚（orcinol）试剂：•称取100mg地衣酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。–二苯胺试剂：•称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。三、实验材料•试剂–0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；–1mol/L氯化钠溶液，250ml；–95%乙醇（冷）；–氯仿；–异戊醇。三、实验材料•实验器材–冷冻离心机（3000rpm）；–组织捣碎机或组织匀浆器；–不锈钢剪刀；–冰浴；–试管、试管夹；–量筒、吸管；–带塞比色管、带塞离心管。–玻棒、烧杯；–电炉等。四、实验方法1.制匀浆–将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。–将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。上层液倾出留待抽提RNA，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。四、实验方法2.核酸的抽提–RNA的提取•0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。•用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。四、实验方法2.核酸的抽提–DNA的抽提•将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min，离心20min。将其上清液加入2倍体积的冷95%乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠绕在玻棒上待定性。•每次都需采用冷冻离心。四、实验方法3.定性试验–RNA的呈色反应•取2支干净试管，一管加入1.5mlRNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。–DNA的呈色反应•取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。五、注意事项•在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0℃左右)进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。•加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA断裂。•要学会正确使用离心机，离心后，注意上清液和沉淀的取舍。六、项目总结及练习1.从动物组织（猪肝）中提取核酸，第一步是破碎肝脏组织细胞，请问破碎动物细胞的物理方法主要有哪些？（列举5种）–①研磨法；②组织匀浆法；③渗透压变动法；④超声波处理法；⑤反复冻融法等。六、项目总结及练习2.为什么在0.14mol/LNaCl溶液中要加0.01mol/L的柠檬酸，或者说，柠檬酸或柠檬酸钠的作用是什么？与柠檬酸作用相同的物质还有哪些？（最少1种）–在核酸提取过程中要防止核酸降解。DNA酶可降解DNA，但DNA酶的活性需要Mg2+、Ca2+等金属二价离子的激活，柠檬酸或柠檬酸钠能螯合这些金属二价离子，从而抑制DNA酶的活性。–与柠檬酸作用相同的物质还有EDTA、TA等，它们都是金属螯合剂。六、项目总结及练习3.猪肝经组织捣碎机破碎细胞，制得的匀浆于3000rpm离心20～30min，所得沉淀用二倍体积1mol/LNaCl溶液抽提1h。请问什么叫抽提？–抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理，使细胞破碎后的目的成分充分地溶解到提取液中的过程。六、项目总结及练习4.RNP和DNP经0.14mol/LNaCl溶液处理并离心分离后，可分别用蛋白质变性沉淀剂来去除其中的Protein。请列举4种常用的蛋白质变性沉淀剂。–①氯仿；②苯酚；③十二烷基硫酸钠（SDS）；④三氯醋酸等。六、项目总结及练习5.为有效去除RNP和DNP中的Protein，本项目采用等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min。请问异戊醇的作用是什么？–异戊醇的作用是消泡和有助于分相。六、项目总结及练习6.在经氯仿去除蛋白质并离心后的上清液中，加入2倍体积的冷95%乙醇，低温放置15min，3000rpm离心20min，所得沉淀即为RNA或DNA沉淀。请问95%乙醇的作用是什么？–核酸不溶于乙醇，乙醇主要起沉淀和除盐作用。六、项目总结及练习7.地衣酚又叫什么？在临床上有何用途？用其鉴定RNA的条件和原理是什么？–地衣酚又称苔黑酚、地衣二酚、3,5-二羟基甲苯、苔黑素等。–临床上，已广泛用于治疗浅层霉菌病和霉菌性阴道炎。–RNA水解后得到核糖，在浓酸中脱水环化生成糠醛，后者与地衣酚，形成蓝绿色复合物，在670nm处有一最大吸收峰。在一定浓度下，RNA浓度与吸光度成线性关系。8、金属螯合剂（metalchelatingagent）•金属螯合剂可以通过螯合剂分子与金属离子的强结合作用，将金属离子包合到螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大的化合物，从而阻止金属离子起作用，可以用于解毒，印染，阻垢等方面。四、蛋白质的变性–影响因素：•温度•紫外线、超声波•剧烈震荡、搅拌•强酸、强碱•有机溶剂、表面活性剂•重金属盐•胍、尿素等第五节蛋白质的性质4、SOD活力测定（邻苯三酚自氧化法）分别检测提取液、粗酶液、酶液1、酶液2中SOD活力。试剂/ml空白管OD1OD2对照管提取液粗酶液酶液1酶液2pH8.3缓冲液333333SOD提取液000.10.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.20.2加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。分别从1ml备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50×粗酶液稀释:20×酶液稀释:10×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280–0.74A260)×稀释倍数5、溶液中可溶性蛋白含量测定6、计算：酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到50%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力酶活力单位•酶活力的高低以酶活力单位（U）表示。•酶活力单位的含义是指酶在最适条件下，单位时间内，酶催化底物的减少量或产物的生产量。•1961年国际酶学会议规定：1个酶活力国际单位（IU）是指在特定条件下，1分钟内生成1微摩尔产物的酶量（或转化1微摩尔底物的酶量）。酶的比活力•酶的比活力（specificactivity）代表酶制剂的纯度。•国际酶学委员会规定比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。•对于同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。