食品中化学残留物高通量高灵敏检测技术的研究

附件4论文中英文摘要格式作者姓名：彭池方论文题目：食品中化学残留物高通量高灵敏检测技术的研究作者简介：彭池方，男，1975年6月出生，2004年9月师从于江南大学金征宇教授，于2008年7月获博士学位。自2003年，作为主要执行人之一，参加了国家“十五”、“十一五”攻关和国家自然基金等多项与食品安全及检测技术相关的基础和应用领域的课题研究，并在国内外期刊杂志上发表论文30多篇，其中SCI收录24篇；参编食品安全领域相关专著2部；获得授权国家发明专利4项；荣获2008教育部级科技进步二等奖1项（排名第二），以及2005、2007年中国石化协会科技进步二等奖2项（排名第二）。中文摘要我国食品中化学残留物问题比较突出，监测工作量较大。目前主要采用理化分析方法开展化学残留物监测工作，但理化分析方法的检测成本较高、检测时间较长，大大制约了食品中化学残留物监测工作的广泛开展。开展化学残留物筛选检测技术的研究对提高化学残留物的检测效率具有重要的价值。免疫分析方法是化学残留物筛选检测的主要方法，具有高特异性、高灵敏度和高通量等优点，其中开发和应用食品中多种化学残留物的免疫分析方法是人们非常关注的领域之一。本论文针对食品中主要化学残留物之一的激素残留，以制备筛选得到的特异性识别多种激素的抗体为基础，发展了酶联免疫吸附分析（ELISA）、毛细管电泳免疫分析激光诱导荧光(CEIA-LIF)检测、多残留荧光免疫多分析（FLISA）和胶体金免疫层析试纸条（CGIA）等一系列孕激素的多残留免疫分析方法，并将这些方法应用于食品中激素残留的检测与研究。为食品中化学物残留物的监测提供了高特异性、高灵敏和高通量的新方法。本论文研究工作的主要内容和创新点表现在以下几个方面：1、制备并筛选得到特异识别多种化学残留物的抗体。通过制备醋酸甲羟孕酮（MPA）人工抗原，经动物免疫，筛选得到一种亲和常数为8.1×108L/mol的多克隆抗体。基于此抗体建立的ELISA方法，对MPA检测的IC50值为5.8μg/L。交叉反应分析表明，此抗体能特异识别多种孕激素，可应用于孕激素多残留免疫分析技术和新产品的开发。该工作发表在JournalofFoodScience(2006,71,C44-C50)杂志上（影响因子：1.065），并获得国家发明专利一项（ZL200710019665.7）。2、建立了一种化学残留物的异源ELISA多残留分析新技术,可以显著提高原ELISA方法的灵敏度和群选择性。合成了三个异源人工包被抗原，发现在采用一种异源人工抗原（3-羧甲基肟基-17α-羟基孕酮醋酸酯与卵清白蛋白偶联物，3-CMO-HPA-OVA）作为包被抗原时，比原同源方法更灵敏更高、群选择性更好。此异源免疫分析方法对醋酸甲羟孕酮（MPA）、醋酸氯地孕酮（CMA）、醋酸甲地孕酮（MEGA）和17α-羟基孕酮醋酸酯（HPA）的IC50值分别为1.8、4.5、2.9、2.5μg/L；对MPA的灵敏度为0.05μg/L，线性范围为0.1-15μg/L,对CMA、MEGA和HPA的灵敏度为0.1μg/L，线性范围为0.2-30μg/L；对MPA、CMA、MEGA和HPA其交叉反应率分别为100%、40%、62%和72%。该工作发表在FoodChemstry（2008,109(3):647–653）杂志上（影响因子：3.183），并申报了国家发明专利一项（公开号CN101066998）。以上研究工作的持续性研究得到了国家农业科技成果转化资金项目[207C10080041]的资助，并获得了教育部科技进步二等奖[证书号：2007-227]。3、利用所开发ELISA试剂盒结合仪器确证方法，确定了动物适合激素残留检测的靶组织。研究了脂肪、肌肉、肝脏、肾脏等动物源样品的ELISA检测的处理方法，同时提出了饲料样品快速处理ELISA检测方法。通过ELISA和GC/MS比较分析给药动物组织中醋酸甲羟孕酮的残留，确定肌肉和肝脏为更适合ELISA和GC/MS检测的靶组织。并进一步开发了多种激素ELISA试剂盒，所开发试剂盒能满足激素多残留筛选检测的要求。该工作发表在AnalyticalLetters(2006,39(8):1865-1873)（影响因子：1.281）杂志上。4、建立了针对食品中多种化学残留物的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）确证分析方法。采用溶剂提取、固相萃取净化等样品前处理方法，建立了检测脂肪组织中五种激素，包括MPA、CMA、MEGA、HPA及甲烯雌醇醋酸酯（MLA）的LC-MS/MS确证分析方法，该方法对五种激素的检出限为0.2~0.3µg/kg，定量限为0.5µg/kg。在空白猪脂肪样品中以0.5、1.0和5.0µg/kg三个水平添加时，五种激素的回收率范围在60.5~84.1%之间，RSD范围为8.9~16.8%之间。该方法能满足目前五种激素残留确证分析检测的要求。该工作发表在JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis上(2006，4，616-621)（影响因子：2.629）。5、建立了适合食品中化学残留物检测的CEIA-LIF检测新方法。合成和鉴定了MPA荧光素标记物，通过毛细管电泳免疫分析激光诱导荧光(CEIA-LIF)检测证明其具有免疫反应活性，在此基础上建立了脂肪中醋酸甲羟孕酮的毛细管免疫电泳-激光诱导荧光检测方法。检测脂肪中MPA的检测限为2.5µg/kg，此CEIA方法与ELISA方法相比，具有分析时间短、溶剂消耗小、样品前处理简单等优点。该工作发表在Electrophoresis杂志上(2007,28(6),970-974)（影响因子：3.609）。以上研究工作的持续性研究得到了财政部质检公益性行业项目[200810099-2]的资助。6、提出了一种基于多色量子点标记的食品中多种化学残留物的FLISA检测新技术。将变性BSA生物素化，以生物素化的变性BSA包埋量子点，得到荧光显著增强的量子点复合物。将抗体生物素化，以亲和素为桥，将抗体与量子点结合的形成抗体-亲和素-量子点复合物。通过对五种（类）化学残留物的荧光信号去卷积分析，可以实现同时对五种（类）化学残留物的定量检测，对醋酸甲羟孕酮（乙酰孕激素）、地塞米松，庆大霉素、氯硝西泮及头孢噻呋，检测灵敏度分别为0.1、0.08、0.13、0.16和0.25µg/L。该方法能实现多种兽药同时定量检测，并具有灵敏度高，耗时少，操作简便等特点。该工作发表在BiosensorsandBioelectronics杂志上(2009,24(12),3657-3662)(影响因子：5.143)，并授权国家发明专利一项（ZL200710135000.2）。以上研究工作的持续性研究得到了国家自然科学基金[20871060]的资助，相关成果发表在AnalyticalChemistry杂志上(2009,81,9194–9198)(影响因子：5.78)。7、首次开发了一种孕激素的CGIA快速检测试纸条。通过制备孕激素抗体的胶体金标记物，优化了孕激素CGIA试纸条各种影响因素，开发出一种快速检测孕激素的CGIA试纸条。该试纸条对MPA的检测灵敏度为5μg/L，对CMA、MEGA和HPA的灵敏度为10μg/L。对鸡肉样品，经过液液萃取，该试纸条检测MPA的判定限可达到10μg/kg。对饲药阳性鸡肉样品，该GICA试纸条检测结果均为阳性，表明该方法具有较高的准确性。该工作发表在InternationalJournalofEnvironmentalAnalyticalChemistry杂志上(2007,87(4):275–283)(影响因子：1.026)。以上研究工作的持续性研究得到了国家自然科学基金国际交流合作项目[20911120035]的资助。本论文研究内容为所参编专著《食品安全》（浙江大学出版社，2009）和《食品免疫化学与分析》（科学出版社，2009）相关章节所收录。关键词：化学残留，高通量免疫分析，毛细管电泳，多色量子点，胶体金Studyonhighsensitiveandhighthrough-putdetectiontechniquesforchemicalresiduesinfoodPengChifangABSTRACTChemicalresidueinfoodisanimportantfoodsafetyfactorinChina.Physicochemicalanalysismethodsaretheleadingactorsininspectingchemicalresidueinfoodnowadays,whichhavetheweaknessesincludinghighcostandlowefficiency.Immunoassaymethodshavetheadvantagesofhighspecificity,sensitivityandhigh-through-put,whichareusedasscreeningmethodsforchemicalresidueandcanimprovetheefficiencyofdetection.Multipleximmunoassaymethodsareimportantforrealizesimultaneousdetectingthemultifoldchemicalresidueinfood.Inthisdissertation,antibodyspecificformultifoldacetylgestgans(AGs)waspreparedandseveralnewmultipleximmunoassaymethodshavebeendeveloped,includingenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA),capillaryelectrophoresisimmunoassaylaserinducedfluorescencedetection(CEIA-LIF),multiplexfluorescenceimmunosorbentassay(FLISA)andcolloidalgoldimmunoassaystrip(CGIA).Thedevelopmentandapplicationofnewmultipleximmunoassaymethodsfhavebeenstudiedindetailandaresummarizedasfollows:1.Anantibodyspecificformultifoldchemicalresidueswaspreparedselected.Anartificialantigenofmedroxyprogesteroneacetate(MPA)wasprepared,whichwasappliedtoimmunizingNewZealandrabbits.Anantibodywasobtainedwhoseaffinityconstantwas8.1×108L/mol.TheELISAmethodagainstMPAwasdevelopedandtheIC50was5.8μg/L.AlsotheantibodywasfoundspecificforfourAGsbyanalyzingcross-activity.2.AnewheterologousELISAmethodformultifoldchemicalresidueswasdevelopedwhichwasmoresensitiveandclass-selectivethanthehomologousmethod.ThreeAGs,chlormadinoneacetate,(CMA),17a-acetoxyprogesterone(HPA)andMegestrolacetate(MEGA),wereconjugatedwithcarrierprotein,whichwereapplie