食品微生物检测技术研究进展

食品微生物检测技术研究进展摘要：随着时代的不断发展，人们生活水平不断提高，食品安全问题也越来越受到人们的关注，近几年来，三聚氰氨、苏丹红、漂白剂,地沟油等等一系列的食品安全问题使人们对食品产生了强烈的不信任感，因此，食品微生物检测技术的应用也越来越广泛，同时，食源性微生物的检测技术也趋向迅捷、准确、大通量的方向发展。以往的食品微生物检测技术已经无法应对现代的食品安全问题，检测速度缓慢、检测精度不精确，因此，应当采取新的食品微生物检测技术，现代的检测技术包括色谱法与荧光分析法、阻抗法、放射测量法、ELISA法和生物传感器法。食品微生物检验技术正从传统的培养方法向分子检测方法改进，并向仪器化、标准化、自动化方向发展，这是食品微生物检验技术发展的趋势。关键词：食品微生物；微量生化法；分子生物学；目录前言...............................................................31生化检测技术在食品微生物检测中的应用..............................3（1）快速检验的应用.................................................3（2）免疫学技术在食品微生物检测中的应用..........................3.42代谢学技术在食品微生物检测中的应用................................3（1）电阻抗技术....................................................3（2）微热量计技术..................................................3（3）放射测量技术.................................................3.4（4）接触酶测定技术................................................43分子生物学技术在食品微生物检测中的应用............................4（1）核酸探针技术................................................4.5（2）基因芯片技术..................................................5（3）细菌直接计数技术............................................54仪器法在食品微生物检测中的应用....................................5（1）旋转平板技术和激光菌落扫描仪..................................5（2）流式细胞术(FCM).............................................5.6（3）免疫磁性微球..................................................6（4）电阻电导检测器................................................6（5）自动微生物检测系统.............................................6结论...............................................................7参考文献...........................................................8致谢...............................................................9食品中的微生物按照其对人类有无危害可分为两类。一类是有益菌；例如酵母菌、乳酸菌等，可用来酿造美酒或腌制咸菜；另一类是有害菌，例如大肠菌群及其他肠道性致病菌，它们会引起食物中毒或引发传染病。近年来，随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。以利于对食品进行筛选和检测,最终达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。1生化检测技术在食品微生物检测中的应用1.1快速检验法微生物检测纸片，可分别检测菌落总数、大肠菌群、霉菌、沙门菌、葡萄球菌等，这些纸片快速检测与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高。美国3M公司生产的PF（Petrilm）试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。在大肠菌群检测方面，国际方法报告的是MPN值而不是每g食品中的大肠菌群数，PF法则可以得出精确数据。霉菌快速检测纸片采用25℃或36℃生化培养箱培养48h就可以观察结果，能够准确、快速地反映食品中霉菌的实际污染情况。纸片法与国标法在霉菌检出率上无显著性差异，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶——底物反应法。只需检测食品中大肠菌群、大肠杆菌的有关酶的活性，将荧光产物在365nm紫外光下观察即可。同时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断。众所周知,在病原菌的检测中常应用生化技术进行最终确认,目前已经生产出了多种微型化的生化试剂盒以及鉴别培养基可供临床应用,它通常是将多种培养基或生化试剂集成在特定的微型化的装置或培养基中,将传统方法中需要多次完成的实验在一次完成,从而节约了样品的分析时间和成本。国外有很多产品已经成为AOAC(美国分析化学家协会)认可的方法,国内也有一些生产厂商介入了生化检测试剂盒及仪器的研究。另外已经有细菌生化检测仪器出售,其中包括法国的默里埃的ATB、VITEK、VITEK32系列细菌生化检测系统以及美国PHOENIX细菌鉴定/药敏试验系统等,它们甚至能够检测出细菌的种类来。1.2免疫学技术在食品微生物检测中的应用目前常用的方法有乳胶凝集法、免疫扩散法、免疫磁珠法、免疫沉淀法、免疫色谱法等。免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成。如利用免疫磁珠分离技术可有效地收集、浓缩大量样品中的少量病原微生物，为研究TDH阳性副溶血性弧菌引起的食物中毒的预防提供了重要的应用价值。胶体金免疫层析法可用于迅速检测沙门氏菌，将抗沙门氏菌多抗用抗原吸收法封闭与其他肠道杆菌的交叉反应，标记胶体金溶胶制成探针，采用多膜复合的方法制成免疫层析条，科学家们应用电化学发光免疫学技术、生物素-亲和素ELISA、荧光ELISA和膜富集免疫学技术相结合也能在较短时间内获得明显的结果。基于此类方法生产的商品化检测试剂盒能够检测弯曲杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌等多种病原菌。虽然免疫学方法具有很多的优点,但是仍然有许多需要改善的地方,比如交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等。近年来还有一种ATP生物发光法,它是发展较快的用于食品生产加工设备洁净度检测的快速检测方法,主要原理是细菌ATP的量与细菌数成正比,从而测量细菌ATP和体细胞ATP,用这种分析技术检测肉类食品细菌污染状况时能够达到快速适时的目标。2代谢学技术在食品微生物检测中的应用2.1电阻抗技术电阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中,会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等,代谢为具有电活性的小分子物质,如乳酸盐、醋酸盐等,这些离子态物质能增加培养基的导电性,使培养基的阻抗发生变化,通过检测培养基的电阻抗变化情况,即可判定细菌在培养基中的生长繁殖特性[2]。该法已用于食品中细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、霉菌和支原体的检测,具有高敏感性、特异性、快反应性和高度重复性等优点。李小燕[3]应用法来快速检测鲜奶中大肠菌群。2.2微热量计技术微热量计技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量,用微量热计测量产热量等数据,均存储于计算机中,经过适当信号上的数字模拟界面,在记录器上绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图。根据这些实验所得的热曲线图和已知细菌热曲线图直观比较,即对细菌进行鉴别。刘永军等[4]采用该技术研究细菌的抑制作用。2.3放射测量技术放射测量技术是根据细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物的CO2的原理,把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测的。在细菌生长时,这些底物被利用并释放出含放射性的14CO2,然后通过自动化放射测定仪Bactec测量14CO2的含量,从而根据14CO2含量的多少来判断细菌的数量。这一方法已用于测定食品中的细菌,具有快速、准确度高和自动化等优点。减改华等应用放射测量技术对大肠杆菌进行定量检测。2.4接触酶测定技术接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶的纸盘,在盛有H2O2的试管中的漂浮时间来估计菌数。接触酶与H2O2之间产生生化反应,放出氧气,使纸盘由试管底部浮到表面。当样品中接触酶含量高时,纸盘上浮的时间短。大多数腐败微生物是嗜冷性细菌。而大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性,故可以用接触酶反应来估计食品中的嗜冷性菌群。3分子生物学技术在食品微生物检测中的应用随着微生物学、生物化学和分子生物化学的飞速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中,核酸探针和聚合酶链反应,以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物,业已逐步应用于食源性病原菌的检测。3.1核酸探针技术将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记,加入已变性的被检DNA样品中,在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链,从而达到鉴定样品中DNA的目的,这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同,可将其分成DNA探针或RNA探针;根据选用基因的不同分成两种,一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应,它对某些菌属、菌种、菌株有特异性,另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应,它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。核酸探针检测技术的最大优点是:①特异性;②敏感性。但探针检测技术中也存在一定的问题,如检测一种菌就需要制备一种探针;要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养;探针检测是分析基因序列,对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测。3.2基因芯片技术基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展,该技术是通过把巨大数量的寡核苷酸,肽核苷酸或cDNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片。它主要是基于近年来的一种全新的DNA测序方法之一杂交测序法而产生的。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上,所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析,解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂,操作序列数量少等缺点。基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化。与传统方法相比,生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势,它可以在一张芯片同时对多个患者进行多种疾病的检测。3.3细菌直接计数技术主要包括流式细胞仪（flowcytometry,FCM）和固相细胞计数（solidphasecytometry,SPC）法。流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光