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第一章绪论一、概述1、微生物的基本特点：体积小，比表面积大；吸收多，转化快；生长旺，繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多二、食品微生物检验1、概念：运用微生物的理论与技术，研究外界环境和食品中的微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响，建立食品微生物学检验方法，确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性学科。“食品卫生”与“食品安全”：1986年，世界卫生组织在题为《食品安全在卫生和发展中的作用》的文件中，曾把“食品卫生”与“食品安全”作为同义词，定义为：“生产、加工、储存、制作食品过程中确保食品安全可靠，有益于健康并且适合人消费的种种必要条件和措施”。2、意义（一）有害微生物对人类和生产的影响：1.引起食品变质2.引起食物中毒3.导致人体患病(二)食品微生物检验的意义1、是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据。2、可以判断食品加工环境及食品卫生的情况，为卫生管理工作提供科学依据。3、可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生。4、保证产品的质量，避免不必要的损失3、研究特点1）研究对象以及研究范围广2）涉及学科多3）实用性及应用型强4）采用标准化4、研究范围1）生产环境（车间用水、空气、地面、墙壁等）；2）原辅料（食用的动、植物，添加剂等）；3）食品加工、储藏、运输、销售等环节；4）成品食品。5、研究任务1）研究各类食品中微生物种类、分布及其特性；2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量；3）研究食品中致病性、中毒性、致腐性微生物；4）研究微生物与食品保藏的关系；5）研究各类食品中微生物的检验方法及标准。6、食品微生物检验的发展过程1）致病菌检测阶段2）指示菌检测阶段（1指示菌：在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。（2特点：在环境中存在的数量多，易于检出；检测手段与方法简单；具有一定的代表性。（3）检验目的：以指示菌在检验样品中存在与否以及数量的多少为依据，根据检出的情况，判断样品被污染的程度，间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁，对照国家标准，对检品的食用的安全性作出评价。（4）类型评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性指标：菌落总数、霉菌、酵母菌等；特指粪便污染指标：大肠菌群、肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等；其他指示菌：包括某些环境不能检出的菌类。菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，经过处理，在一定条件下培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，所得1g或1mL或1cm2检样中所含细菌菌落数量即为菌落总数，常用CFU（菌落形成单位，clonyformingunit）表示。大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。这些细菌均来自人和温血动物的肠道。3）微生态制剂检测阶段以乳酸茵、双歧杆菌为主，以调节生态平衡为目的的各种微生态制剂，检验其菌株的特性和数量。4）现代基因工程菌和尚未培养菌的检测阶段5）快速检测阶段化学比色分析法、酶联免疫法（ELISA)、免疫胶体金试纸检测法。生物芯片、传感器、色谱质谱检测仪。特点：实验准备简化、试剂少；样品前处理简单；分析方法简单、准确、快速。第二章食品微生物检验技术第一节培养基在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基。一、培养基中的主要成分及其作用（一）营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水。1、常用的N源物质：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏2、糖、醇类物质单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖多糖：淀粉、纤维素、菊糖醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油（二）水用蒸馏水，不能用自来水。（三）凝固剂琼脂、明胶、血清等。要求：清一色、杂质少。（四）抑制剂1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率。2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等。染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红。胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐。抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素。（五）指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。二、培养基的类型由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。（一）根据培养基的物理状态来区分1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养，大型生产、科研等。2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。3、半固体培养基：观察微生物的动力，菌种鉴定等。4、脱水培养基：含有除水分外的一切成分的商品培养基，使用时加水灭菌。（二）根据培养基的用途来区分1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。2、选择培养基：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。分离培养用的培养基名称用途SS琼脂培养基沙门氏菌和志贺氏菌属分离HE琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂培养基绿脓杆菌分离鉴别XLD琼脂培养基志贺氏菌、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基霍乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离3、鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。名称用途蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（TST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化钾基础培养基沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验三、培养基制备的基本方法和注意事项1、培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间，制备的日期和制备者等。2、培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于旁侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。3、培养基各成份的混合和溶化指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。4、培养基pH的初步调正灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；pH调整后，还应将培养基煮沸。5、培养基的过滤澄清液体培养基可用滤纸过滤法。琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。6、培养基的分装斜面：1/５管半固体培养基：1/3管高层斜面：1/4～1/3管平板：13~15mL7、培养基的灭菌（1）含糖类或明胶的培养基：113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。（2）无糖培养基：121℃灭菌15~20分钟。（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。8、培养基的质量测试（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等,均应挑出弃去。并测定其最终pH。（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好,应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。9、培养基的保存（1）基础培养基不能超过两周。（2）生化试验培养基不宜超过一周。（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。培养基配制——器材：培养基、玻璃器皿、天平、药匙培养基配制——仪器：灭菌锅、无菌操作台培养基配制——装水：以量桶装取适量蒸馏水于玻璃容器中；于玻璃容器上标示培养基名称。培养基配制——称药：放上秤药纸并归零；以秤药匙舀出适当量培养基培养基配制——溶解培养基：倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上注意事项——配药结束：清理配药桌面与天平；清洗称药匙，擦干放回；药品放回药品柜培养基配制——分装：调整分注器刻度；分装试管；盖上试管盖培养基配制——灭菌：放入灭菌锅灭菌注意事项：拿灭菌后物品记得带耐热手套培养基的配制–平板培养基：灭过菌的固态培养基于无菌操作台內倒制平板培养基第二节微生物检验的基本操作技术一、无菌技术（一）什么是无菌技术？指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境：无菌室、无菌柜、超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间。（2）无菌室的消毒和防污染：每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）。每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）。每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次。2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10－15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等。消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。2、进入无菌室前的准备（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；（3）检查无菌器材是否完备；（4）洗手消毒；（5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；（3）在火焰正上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，动作应轻、准；（6）不能用嘴直接吸吹吸管；（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。无菌操作——取菌技巧(从斜面取菌）1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红，后端铁棒部分过火。2.试管前端过火。3.打开试管盖。4.试管倾斜，放入接种环。无菌操作——取菌技巧(从平板取菌）1.自平板上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入；方法二：平板反面拿起)。无菌操作——取菌技巧（从液体内取菌）1.调整移液枪刻度。2.插上灭过菌的枪头(用力插紧)。3.按钮压至第一段(不可压至最底)。4.深入液面下2-4mm。5.慢慢释放按钮，即可吸取液体。无菌操作——接菌技巧1.试管前端过火。2.打开试管盖。方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌。方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液。方法三：以移液枪吸取菌液，按钮压至最底排出菌液。无菌操作——错误示范试管直放，空气中菌体容易掉入。操作时距离火源远。移液枪倒放，菌液容易流入。注意事项——生物性废弃物：放在正确位置以便灭菌。二、微生物的接种与分离技术（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法接种和分离工具：接种针；接种环；接种钩；玻璃涂棒；接种圈；接种锄；小解剖刀常用的接种方法有以下几种：1）划线接种：在固体培养基表面作来回直线的移动。2）三点接种：把少量微生物接种在平板表面上成等边三角形的三点，让他们各自独立形成菌落。3）穿刺接种：用接种针蘸取少量菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。4）浇混接种：将待接的微生物先放到培养皿中，然后倒入冷却好的培养基，迅速轻轻摇匀，待平板凝固后，置于适宜温度下培养。5）涂布接种：先倒