食品微生物检验课程设计指导书

吉林工程技术师范学院食品工程学院《食品微生物检验》综合实训设计题目：《国标》沙门氏菌检测学生姓名：王林班级学号：34号指导老师：金明晓王陆玲2012年11月30日食品微生物检验综合实训前言本标准代替GB/T4789.4-2008《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》。本标准与GB/T4789.4-2008相比，主要变化如下——修改了标准的中英文名称；——修改了标准的范围；——修改了培养基和试剂；——修改了设备和材料；——修改了附录A。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替的历次版本发布情况为：——GB4789.4-84、GB4789.4-1994、GB/T4789.4-2003、GB/T4789.4-2008。食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验1范围本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱：2℃～5℃。恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。均质器。振荡器。电子天平：感量0.1g。无菌锥形瓶:容量500mL，250mL。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌培养皿：直径90mm。无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。无菌毛细管pH计或pH比色管或精密pH试纸。全自动微生物生化鉴定系统。培养基和试剂缓冲蛋白胨水（BPW）：四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液亚硫酸铋（BS）琼脂HE琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂沙门氏菌属显色培养基。三糖铁（TSI）琼脂蛋白胨水、靛基质试剂尿素琼脂（pH7.2）氰化钾（KCN）培养基赖氨酸脱羧酶试验培养基糖发酵管邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基半固体琼脂丙二酸钠培养基沙门氏菌O和H诊断血清生化鉴定试剂盒课程目的：掌握沙门氏杆菌的国家标准检查方法课程意义：通过对本课程设计的学习，要求学生掌握食品微生物检验的基础理论知识、沙门氏杆菌常规的检验原理，了解检验新技术的发展概况；并通过检验操作技能的训练，正确掌握微生物检验的方法和技能，包括微生物检验常用器材的使用方法和技能、生化试验和血清学试验方法和技能、微生物检验的样品处理技术、食品微生物卫生指标菌沙门氏杆菌的检验和报告的撰写等内容，对《中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法微生物部分》（简称国标）具有较强的应用能力和执行能力，使学生能较好地胜任食品微生物检验的有关工作。同时还重视学生的职业道德教育和法制教育，重视培养学生的诚信品质、敬业精神和责任意识、遵纪守法意识、团结合作意识，以提高学生的实践能力、创造能力、就业能力，为毕业后的就业打下良好的基础。材料准备：1．器材：灭菌锅、干燥箱、水浴锅、温箱、冰箱、电子天平、无菌吸管、三角瓶、培养皿、试管、无菌毛细管、精密pH试纸、酒精灯、接种环等。2．培养基：缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂（TSI）、蛋白胨水（靛基质试验用）、赖氨酸脱羧酶试验培养基、尿素琼脂、ONPG培养基。方法步骤:（一）培养前增菌牛乳称取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥型瓶中，振荡混匀。于36℃士1℃，18h进行培养。1、增菌对已污染的被检材料牛乳等先用煌绿增菌培养基增菌培养后再进行分离。37℃培养18～24h，观察其在各种培养基上的菌落特征。轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃士1℃培养18h一24h。2、分离培养分别用接种环取增菌液1环，划线接种：二个BS琼脂平板36℃士1℃40h一48h二个XLD琼脂平板36℃士1℃18h一24h二个HE琼脂平板36℃士1℃18h一24h观察各个平板上生长的菌落。沙门氏杆菌在木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、HE琼脂、形成无色或与培养基颜色相同、透明或半透明、中等大小、表面光滑的菌落。（二）生化试验钩取鉴别培养基上的几个可疑菌落分别纯培养，自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃士1℃培养18h-24h，必要时可延长至48h，观察结果。沙门氏杆菌只发酵葡萄糖，不利用乳糖和蔗糖，故在三糖铁培养基生长后，培养基底层呈黄色，斜面部分仍为红色；多数菌株产生硫化氢，使培养基底层呈黑色；因其尿素酶阴性，故在尿素琼脂上生长，培养基不变色。接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、将已挑菌落的平板储存于2℃-5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。糖发酵试验取纯培养物接种甘露醇、山梨醇发酵管，37℃培养2～3d，观察结果。吲哚试验取纯培养物接种蛋白胨水，37℃培养2～3d，加入吲哚试剂，观察结果。尿素挑取琼脂培养物接种，在36℃±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。（1）A1典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌属。如有2项异常，为非沙门氏菌属。（2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。（3）A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。（三）血清学鉴定试剂（诊断血清）：含抗体检测对象：特异性抗原方法：用接种环沾取少许沙门氏杆菌血清置于玻片上，再钩取几个菌落于之混匀，出现凝集为阳性反应。诊断血清（含沙门氏菌抗体）+待检测细菌细菌凝集（对照：加1-2菌环生理盐水）玻片凝集试验：阳性报告：检出沙门氏菌现象分析1.在三糖铁试验中，能看到试管斜面底部有黑色沉淀，在斜面表面有浅黄色菌落，部分还是红色，为阳性。2.在尿素琼脂实验中，培养基不变色，为阴性。3.在吲哚实验中，在液面与吲哚试剂界面出现粉红色圈，为阳性。4.在糖发酵试验中，山梨醇与甘露醇变成了黄色，即为阳性。结果报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌属细菌。一、缓冲蛋白胨水（BPW）1成分蛋白胨10g氯化钠5g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）9g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mlpH7.22制法按上述成分配好后以大烧瓶装，121℃高压灭菌15min。临用时无菌分装每瓶225ml。注：本培养基供沙门氏菌前增菌用二、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）1基础培养基多胨或胨5g胆盐1g碳酸钙10g硫代硫酸钠30g蒸馏水1000ml2碘溶液碘6g碘化钾5g蒸馏水20ml3制法将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100ml。分装时应随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。121℃高压灭菌15min备用。临用时每100ml基础培养基中加入碘溶液2ml，0.1%煌绿溶液1ml。三、亚硫酸铋琼脂（BS）1.成分蛋白胨10g牛肉膏5g葡萄糖5g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4g煌绿0.025g柠檬酸铋铵2g亚硫酸钠6g琼脂18~20g蒸馏水1000MlPH7.52.制法将面前5种成分溶解于300mL蒸馏水中；将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解；将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解,冷至80度。将以上三液混合并补充蒸馏水至1000mL,校正PH,加0.5%煌绿水溶液5mL,摇匀.冷至50~55度,倾注平皿.注:此培养基不需高压灭菌.制备过程不宜过分加热,以免降低其选择性.应在临用前一天制备,贮存于室温暗处.超过48小时不宜使用.四、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂1.成分酵母粉3.0gL-赖氨酸5.0g乳糖7.5g蔗糖7.5g木糖3.5g氯化钠5.0g硫代硫酸钠6.8g柠檬酸铁铵0.8g去氧胆酸钠2.5g酚红0.08g琼脂13.5g蒸馏水1000mLPH值7.4±0.22.制法制备将上述成分（酚红除外）溶解于1000mL蒸馏水，加热溶解。调至pH7.4士0.2。再加入指示剂，待冷至50℃-55℃倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。五、HE琼脂1.成分胨12g牛肉膏3g乳糖12g蔗糖12g水杨素2g胆盐20g氯化钠5g琼脂18~20g蒸馏水1000mL0.4%溴麝香草酸蓝溶液16mLAndrade指示剂20mL甲液20mL乙液20mL2.制法将前面7种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内,加热溶解.加入甲液和乙液于基础液内,校正PH.再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃,倾注平板.注1:此培养基不可高压灭菌注2:甲液的配制硫代硫酸钠34g柠檬酸铁铵4g蒸馏水100mL注3:乙液的配制去氧胆酸钠10g蒸馏水100mL注4:Andrade指示剂酸性复红（酸性品红）0.5g1mol/L氢氧化钠溶液16mL蒸馏水100mL将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。室温下放置过夜。如果复红至草黄色，再入氢氧化钠溶液1~2mL。六、三糖铁琼脂（TSI）1.成分蛋白胨20g牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g氯化钠5g硫酸亚铁钠[Fe(NH44)2(SO4)2.6H2O]0.2g硫代硫酸钠0.2g琼脂12g酚红0.025g蒸馏水1000mlPH7.42.制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正PH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀。分装试管，装置宜多些，以便得到较高的底层。121摄氏度高压灭菌15min，放置高层斜面备用。七、蛋白胨水（靛基质试验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化钠5g蒸馏水1000mlPH7.4制法：按上述成分配制，分装小试管，121℃高温灭菌15min。靛基质试剂：柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25ml欧-波试剂：将1g对二甲氨基甲醛溶解于95ml乙醇内，然后缓慢加入浓盐酸20ml实验方法：挑取小量培养物接种，在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管，阳性者于试管层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。八、尿素琼脂成分：蛋白胨10g氯化钠5g葡萄糖1g磷酸二氢钾2g0.4%酚红溶液3ml琼脂20g蒸馏水1000ml20%尿素溶液100mlPH7.2±0.1制法：将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正PH，加入琼脂，加热熔化并分装烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至50℃～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终PH应为7.2±0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。实验方法：挑取琼脂培养物接种，在36℃±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。九、ONPG培养基1成分邻硝基酚β—D—半乳糖苷（ONPG）60mg0.01mol/L磷酸钠缓冲液（PH7.5）10mL1%蛋白胨水（PH7.5）30mL2制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。3实验方法自琼脂斜面上挑取培养物一满环接种于36℃±1℃培养1h～3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。十、赖氨酸成分：蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸馏水1000.0ml1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mlL-赖氨酸或DL-赖氨酸0.5g/100ml或1.0g/100mlpH6.8±0.2制法：除赖氨酸以外的成分加热熔解后，分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5%加入，DL-赖氨酸按1%加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。