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第三章酶的生产、分离和纯化酶来自生物体，包括动物、植物和微生物。酶的生产：经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需要酶的过程。酶生产的方法：1、提取2、化学合成3、发酵法第一节酶的发酵生产50年代后期酶生产的主要方法，指利用动植物细胞或微生物细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。1894年，日本人高峰让吉首次用米曲霉固体发酵生产淀粉酶作为消化剂。1917年，Boidin与Effront以枯草杆菌生产淀粉酶用于织物退浆。1947年，日本开始采用液体深层发酵生产a-淀粉酶。利用微生物发酵方法制取酶的优点是：1）微生物种类繁多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样；2）微生物生长繁殖快，发酵周期短，易提取酶，特别是胞外酶；3）微生物培养简单，培养基来源广泛，价格便宜。4）可采用微电脑等技术控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。5）可利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育新菌种、增加酶产率和开发新酶种。1、产酶菌的获得1）生产菌的要求安全可靠，不是致病菌，在系统发生上与病原体无关，也不产生毒素。FDA(FoodandDrugAdministration)鉴定、审核后认为可用于食品工业和医药工业的生产菌有：枯草杆菌（Bac.subtilis）、黑曲霉（Asp.niger）、米曲霉（Asp.oryzae）、啤酒酵母（Sac.cereusia）、脆壁酵母（Sac.fragieis）。不易变异退化、不易感染噬菌体，产酶稳定性好。产酶量高，酶的性质符合应用需要，最好是产胞外酶的菌株。能利用廉价原料，发酵周期短，容易培养。产酶菌可从菌种保存机构如ATCC（AmericanTypeCultureCollection）和有关研究机构获得；一般都是通过筛选（screening）得到。筛选包括以下环节：菌样采集，菌种分离、纯化和生产性能鉴定。2）常见的产酶微生物细菌：枯草杆菌淀粉酶制糖、脱浆大肠杆菌青霉素酰化酶制备青霉素母核异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶制果糖短小芽孢杆菌碱性蛋白酶皮革脱毛酵母：假丝酵母脂肪酶、尿酸酶等乳品增香、绢丝脱脂等啤酒酵母用于酿造啤酒、饮料酒和酒精等霉菌：黑曲霉酸性蛋白酶啤酒澄清、医药红曲霉葡萄糖淀粉酶制葡萄糖米曲霉糖化酶和蛋白酶制果糖青霉葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酶、果胶酶等木霉纤维素酶根霉淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等毛霉蛋白酶、糖化酶、果胶酶、凝乳酶等3）菌样采集相近菌种产生的酶在性质上一般相近或相似。胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致；但胞内酶的热稳定性通常比菌的最适生长温度稍低。为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质比较丰富的地方寻找。4）菌种分离、纯化和生产性能的鉴定产酶菌可采用平板划线法或直接稀释法分离纯化。初筛多采用平板透明圈法。如筛选水解酶的生产菌，可以该酶的底物作为平板培养基的主要碳源或氮源，这样如果菌株包含所需要的酶，经过一段时间的培养后，就会在菌落的周围形成一透明的水解圈（clearingorlysiszone），从透明圈的大小可大致判断出菌株的产酶能力。5）产酶菌的筛选：主要依靠其催化的反应的性质、底物和产物的特异性等进行设计。胞外酶筛选：使待检测的微生物在含有酶作用的不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等作为培养基中生长，培养后，根据菌落周围产生的透明圈的大小可以晒选到产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和溶菌酶的高活性菌株。(平板透明圈法)根据催化反应的产物的酸碱性，在培养基中加入底物和酸碱指示剂，培养后，依据产生酸或碱，依据菌落周围变色圈的大小和颜色深浅进行判断，从而进行产目标酶菌株的晒选。设计特定的底物，使其在酶的作用下产生产物，产物遇底物有颜色的变化，菌落周围产生色圈，则可筛选到产酶的菌株。胞内酶筛选：对于酶作用的底物分子质量较小，能透过细胞膜在细胞内发生反应，可以将其加在培养基中，根据菌落的颜色进行筛选。对于大多数的胞内酶，是采用培养细胞或细胞破碎物作酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点，利用产物对紫外的吸收，如辅酶NAD，直接用紫外分光光度法测定；或通过产物的显色反应等。2.产酶菌的保存和培养1）菌种的保存防止污染，尽量减少转移次数；避免对种子培养基进行长时间高热灭菌，以防对种子产生不良影响。菌种保存的基本原理：通过采用低温、干燥与缺氧的条件，以中止菌种的繁殖，降低其新陈代谢，使之处于休眠状态。菌种保存的方法很多，常用的为斜面低温保存法，液体石蜡保存法等。有条件的还可采用冷冻真空干燥保存法。2）菌种的活化和扩大培养将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养以恢复菌种的活力，这就叫菌种活化。为了发酵时有足够的菌种，活化了的菌种一般要经过一级至数级的扩大培养。3）培养方法固体培养。又称表面培养（surfaceculture）、曲式培养，即以麸皮、米糠等为基本原料，再加入适量的无机盐和水分（通常50%左右）作为培养基进行的一种培养方式。设备简单，便于推广，特别适于霉菌类的培养，因为菌丝体在这种培养基中能较好地伸展、生长，产酶率高。如曲霉和毛霉生产淀粉酶和蛋白酶，青霉和曲霉生产果胶酶，木霉生产纤维素酶；缺点是：物料利用不完全，劳动量大，易染菌，而且不适于胞内酶的生产液体培养。又称浸没式培养（submergedculture），采用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气式培养，是目前酶制剂和其它发酵产品的主要培养方式。液体发酵需要一定的设备和技术条件，动力消耗也较大，但原料利用率和产量都较高，而且培养条件容易控制。3）培养条件培养基的组成：碳源。不宜使用葡萄糖等易被利用的碳源为培养基，也不宜提供太丰富的碳源营养。某些碳源是酶的诱导物，定向地促进某些酶地合成，如淀粉可诱导淀粉酶的合成。氮源。氮源是菌体蛋白质和核酸的原料。各种微生物对氮源的利用情况相当复杂，有的喜欢无机氮，有的喜欢有机氮，氮源的性质，使用的浓度都能对菌的生长和酶的形成带来不同程度的影响。碳氮比。在某些情况下，对菌的生长和产酶也有直接关系。无机盐。这些离子直接参与细胞物质的组成，或者作为酶的活性组成部分与活化剂发挥作用。生长因子。一些微量有机物质，主要是B族维生素。它们对微生物的代谢起调节作用，有时作为辅酶的构成部分，影响酶的活性。在玉米浆、酵母膏和麦芽浸液等天然物质中通常含有这些生长因子，不需要另外添加。产酶促进剂。指在培养基中添加某种少量物质,能显著提高酶的产率,这类物质称为产酶促进剂。通常有两种:一种是诱导物，可以是底物、产物或底物类似物。如纤维二糖诱导纤维素酶。另一种是表面活性剂，如吐温-80的浓度为0.1%时能增加许多酶的产量,增加细胞的通透性，改善氧的传递速度,还可保护酶的活性影响菌种产酶的因素：◆培养温度。产酶菌生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。培养温度也可能直接影响酶合成后的稳定性，特别是酶的耐热性。如：55℃下培养形成的α-淀粉酶的热稳定性比35℃培养的高许多。◆pH。培养基的酸碱度对产酶影响很大。相当多的水解酶，产酶的最适pH与酶作用的最适pH相近；有些水解酶和氧化酶则相距甚远。很多微生物能同时产生几种相关的酶，改变培养基的pH，可能影响到各种酶的合成比例。通气量。大多数产酶菌是好气菌，因此调节通气量对提高酶产量往往有直接意义。采用液体深层发酵时，较小的通气量有利于霉菌的孢子萌发和菌体生长。而较大的通气量则常可促进酶的形成。固体发酵时，菌体生长通常要求通以空气，而较小的通气量却能显著提高酶的产量。湿度。对于固体发酵比较重要，它直接影响产酶率，也与产酶达到高峰的时间有关。第二节提高酶发酵产量的方法1、酶的合成调控机制酶和其它蛋白质一样，它的合成可在复制（replication）、转录（transcription）和翻译（translation）等各种水平上进行调节控制。原核生物的转录调节机制现在普遍接受的是操纵子模型。这是通过调节酶的合成来调控。另外可通过抑制酶的活性来调控。细胞所生产的物质的合成有两个负的调节系统，即通过抑制酶的活性和阻遏酶的合成来调节。1）诱导酶合成的调节(添加诱导物提高酶产量)适用于可诱导的酶类，食品工业应用的酶如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶等均属于诱导酶。在酶合成时最好的诱导物为该酶的作用底物或其结构类似物。加入诱导物后，通常要经过一个极短暂的潜伏期(例如几分钟)，诱导才会出现，除去诱导物后，诱导立即停止。2）酶合成的反馈阻遏(通过降低阻遏物浓度提高酶产量)反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生的阻遏作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，也称为共阻遏物。调节基因产生立体阻遏物，当终产物或共阻遏物存在时，两者相互结合并与操纵基因结合，RNA聚合酶不起作用，使操纵基因关闭，酶合成受到反馈抑制。若解除阻遏物即无终产物,RNA聚合酶起作用，使操纵基因开启，酶合成继续.3）分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢阻遏作用（或称为葡萄糖效应）是指培养基中由于葡糖糖的存在微生物虽然能迅速生长，但明显抑某些分解代谢诱导酶的形成。葡萄糖的存在影响细胞内环腺苷酸（cAMP）的产生，cAMP是启动RNA聚合酶作用中不可缺少的辅助因子，cAMP的缺少导致对分解代谢的酶形成阻遏作用。4）酶合成的细胞膜透性调节调节胞外酶的分泌主动运输的调节（透性酶或表面酶）间隔作用调节（酶的催化速率受到亚细胞器结构的影响）2、通过发酵条件的控制提高酶产量菌种产酶性能是决定发酵效果的重要条件。为了提高酶产量，需对发酵过程的参数进行优化。(1)通过控制pH来提高酶产量(2)通过控制温度来提高酶产量(3)通过中间补料提高酶产量(4)通过溶解氧来提高酶产量溶氧速率的调节方法：◆调节通气量◆调节氧分压◆调节气液接触时间和面积3、通过基因突变提高酶产量基因突变（genemutation）可发生在结构基因上，也可发生在操纵子其它部位上。前者往往导致酶的结构和性质改变，而后者则通常引起酶产量升高或降低。基因突变可自发地发生，即自然育种，但机率很小，故在实际工作中需采用某些方法进行诱变，即诱变育种：物理方法：紫外线、γ-射线（Co-60）及快中子辐射等。直接引起核酸分子中四种脱氧核苷酸，特别是C、T发生变化，造成DNA损伤和畸变。化学方法：5-溴尿嘧啶等，通过代谢渗入到DNA中引起突变；亚硝胍等，直接和DNA中地A、C、G等反应而导致异变；口丫啶黄染料等，能引起DNA链中核苷酸的插入或缺失而造成移码突变。生物诱变剂：噬菌体用来进行诱变的出发菌株选择时应注意以下几点：（1）有一定的目标产物的生产能力（2）对诱变剂敏感的菌株变异幅度大（3）生产性能好的菌株（4）可选择已经诱变后的菌株筛选的目的（1）高产菌株的筛选（2）抗分解代谢阻遏突变株的筛选（3）无孢子突变株的筛选（4）药物抗性突变株的筛选4、通过基因重组提高酶产量体内基因重组（generecombination），包括通过接合、转导、转化等方法进行的少数或者个别基因的重组；也包括通过原生质融合进行的整个染色体的重组。如：质粒（plasmid）整合、噬菌体转导（phagetransduction）、转化、原生质融合（protoplastfusion）。体外基因重组（generecombinationinvitro），简称DNA重组技术（recombinatantDNAtechnique），或基因工程（geneengineering）。它是利用酶学方法将外源基因与载体DNA在体外进行重组，然后将形成的重组子转化到受体细胞，使所需要的外源基因在受体细胞中复制表达，从而达到改造生物遗传特性目的的一种技术与方法。5、其他提高酶产量的方法（改变碳氮比，添加产酶促进剂等）添加表面活性剂。表面活性剂，特别对胞外酶来说，可能因为能增大细胞膜的通透性，从而提高酶产量。常用的表面活性剂有:Tween80、TritonX-100(聚氧乙烯异辛基苯基醚)、油酸等。或是酶的诱导物。食品常用酶发酵生产举例：α-淀粉酶的生产枯草杆菌糖化酶的生产黑曲霉蛋白酶的生产脂肪酶的生产假丝酵母果