铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物相关耐药机制的研究进展

铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物相关耐药机制的研究进展王国欣1综述许宏涛2审校（1.中南大学湘雅医学院医学检验系;2.卫生部北京医院检验科）[摘要]铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制极为复杂,主要包括药物作用靶位的改变、外膜通透性降低和主动泵出作用等,其中药物作用靶位的改变是国内外研究的重点。本文就近几年来有关的研究进展进行简要综述。[关键字]铜绿假单胞菌;喹诺酮类药物;耐药机制铜绿假单胞菌是一种能引起严重化脓性感染的条件致病菌。尤其多见于抵抗力低下，长期住院患者出现的院内感染。由于其对多种抗菌药物表现出天然耐药,使得治疗铜绿假单胞菌感染、控制其传播和流行十分困难。目前在抗生素领域内,喹诺酮类药物被认为是治疗铜绿假单胞菌最有效的药物之一［1］。但随着其广泛应用,细菌在抗生素选择性压力下不断出现新的耐药机制而导致耐药性不断增强,造成临床治疗困难甚至失败。因此研究铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性和耐药机制,可以为临床合理用药、减少耐药发生以及新的喹诺酮类药物的开发提供依据。1喹诺酮类药物的作用机制喹诺酮类药物是一类以1,4-二氢-4-氧-3-喹啉羧酸为基本结构的全合成抗菌药物。喹诺酮类药物的作用靶位是细菌DNA复制Ⅱ类拓扑异构酶，包括DNA旋转酶（DNAgyrase）和拓扑异构酶IV（to-poisomerase-IV）［2］,前者由两对亚基GyrA和GyrB组成，分别由GyrA和GyrB基因编码，参与DNA超螺旋形成；后者由ParC和ParE基因编码，参与细菌子代染色质分配到子代细菌中。铜绿假单胞菌是革兰阴性菌，以DNA促旋酶作为第1靶位。DNA促旋酶暂时切断DNA双链,氟喹诺酮类药物通过嵌入断裂DNA链中间,形成DNA-拓扑异构酶-氟喹诺酮类三者复合物,阻止DNA拓扑异构变化,妨碍细菌DNA复制、转录、以达到杀菌目的。深入研究发现,细菌DNA被切断后,末端与酶第122位酪氨酸结合,该位点在空间上与第88位氨基酸相邻,第88位氨基酸与周边氨基酸共同构成喹诺酮类药物结合位点,该区域被称为喹诺酮类耐药决定区(quinoloneresistantdeterminingregion,QRDR)［3］。2铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制极其复杂，大量研究表明其耐药机制主要包括以下3个方面:(1)QRDR基因突变:是编码喹诺酮类药物作用靶位的DNA促旋酶和拓扑异构酶的基因突变,特别是QRDR基因突变,导致酶结构改变,使药物不能与酶-DNA复合物稳定结合。(2)主动外排泵系统:外排泵系统调节基因的变异而导致细胞内药物浓度降低。(3)低渗透性作用:包括外膜渗透性减低及生物膜的作用。2.1药物靶位及编码基因的突变2.1.1DNA促旋酶DNA促旋酶由两对亚基GyrA和GyrB组成,分别由gyrA和gyrB基因编码,GyrA参与DNA的断裂与重新连接,而GyrB则参与ATP酶水解,提供反应的能量。其中任一亚基的基因发生突变均可引起喹诺酮类的耐药。Kukeishi等［4］首先报道了gyrA基因的突变,发现GyrA的序列有以下3种突变方式:Asp-87→Asn、Asp-87→Tyr及Thr-83→Ile。Yonezawa等［5］又发现了3种新的双点突变现象,即Thr-83→Ile和Asp-87→Gly、Thr-83→Ile和Asp-87→Asn、Thr-83→Ile和Asp-87→His。之后Takenouchi等［6］发现了gyrA的7种错义方式,其中有2种新的双点突变,即Ala-67→Ser和Asp-87→Gly、Ala-84→Pro和Gln106→Leu。但Thr-83→Ile仍为最主要的突变方式,并与喹诺酮类的高度耐药有关。Akasaka等［7］研究发现:在150例临床分离的耐药株中,gyrA的突变占79.3%,主要为Thr-83→Ile、Ala;Asp-87→Asn、Gly、Thr。其中又以Thr-83→Ile为多见,约74.7%。有20株在gyrA上有双点突变,以Thr-83和Asp-87的替换最常见,其中16株gyrA双点突变仅发现在氟喹诺酮类高度耐药的菌株中。gyrB的突变株较gyrA少见,仅发现有27株突变,分别为Glu-468→Tyr(1)、Ser-468→Phe(3)、Glu-469→Val(1)、Glu-470→Asp(13)、Thr-437→Met(1)、Ala-477→Val(7)、Glu-459→Ang(1)，同时进行了gyrA密码子的无义突变，主要有CAC→CAT，GAC→GAT等。2.1.2DNA拓扑异构酶DNA拓扑异构酶的两对亚单位ParC和ParE分别由parC和parE基因编码。Mouneimne等［8］对30株耐环丙沙星的铜绿假单胞菌进行研究,发现所有菌株均有类拓扑异构酶的突变,其中28株有gyrA基因错义突变,发生在第83和87位密码子上。10株有parC基因的突变,为:Ser-80→Leu、Trp,Glu-84→Lys。Akasaka等［7］研究发现parC基因的突变主要为Ser-87→Leu、Trp。值得注意的是所有存在parC改变的菌株上都已存在gyrA突变,因此可以肯定parC突变发生在gyrA突变之后,在同时具有gyrA和parC突变的菌株中,以gyrA上Thr-83→Ile和parC上的Ser-87→Leu类型最多见。同样可以肯定,gyrA上的第2个点突变发生在parC点突变之后。ParE的突变型为Asp-419→Asn、Ala-425→Val,但极罕见(3/150)。类拓扑异构酶上有双突变方式的菌株较有单突变方式的菌株对喹诺酮类有更高的耐药性,没有发现仅parC基因突变单独存在的变异株。这些结果表明,gyrA基因的突变是喹诺酮类药物对铜绿假单胞菌临床分离株的主要耐药机制,parC基因的突变只是使耐药性上升到更高水平。2.2主动外排泵系统目前研究发现在不同细菌上至少存在的20多种外排泵,可分为5个家族:主要易化子(majorfacilit-ator,MF)族;小多药耐药(smallmulti-drugresis-tance,SMR)族;耐药节结化细胞分化(resistancenodulati-oncelldivision,RND)族;ATP结合盒(ATPbindingcassette,ABC)族;多药及毒性化合物外排(multidrugan-dtoxiccom-poundextrusion,MATE)族［9］。到目前为止共报道了7类铜绿假单胞菌的主动外排泵系统,MexAB-OprM［10］、MexCD-OprJ［11］、MexEF-OprN［12］、MexXY-OprM［13］、MexJK-OprM［14］、MexHI-OpmD［15］和MexWV-OprM［16］,均属于耐药结节化细胞分化族(RND)。铜绿假单胞菌以喹诺酮类药物为底物的主动外排蛋白有MexAB,、MexCD、MexEF、MexXY等。MexXY-OprM是近年来研究最多的一类多重主动外排系统［17］。OprM不仅是MexAB-OprM外排泵的外膜成分,也是MexXY-OprM的重要组成部分［18］。OprM基因位于基因MexAB的下游,可以和MexAB基因同时或单独复制,而MexXY基因则不位于OprM基因附近。MexXY基因上游的分叉复制基因MexZ编码了MexXY表达的去阻遏因子［19］。在临床分离的耐药株中,已发现主动外排机制与Ⅱ型拓扑异构酶突变共同存在,而多种耐药机制在同一菌株中同时存在,容易产生对药物的高耐药性。Poole等［20］研究发现,高度表达MexCD-OprJ和MexEF-OprN是肺囊性纤维化患者铜绿假单胞菌临床分离株氟喹诺酮类耐药的主要机制。目前已发现了nalB、nfxB、nfxC型的氟喹诺酮多样耐药临床分离株,所有临床分离株均显示靶位改变,高水平的氟喹诺酮类耐药株一般均有主动外排泵突变产生。利用2～4倍于最低抑菌浓度(MIC)的氟喹诺酮在体外选择出的耐药株中90%发生了外排泵突变。有关外排泵调节基因的研究主要集中在mexR、nfxB基因,多数报道mexR、nfxB基因突变引起外排泵表达增高,导致或加重耐药。Jalal等［21］研究了16株氟喹诺酮类耐药临床分离株,发现14株有gyrA位点突变,其中13株为Thr-83→Ile,对诺氟沙星的MIC≥8mg/L。在8株MIC≥32mg/L中,7株有parC突变。16株中共有4株出现mexR基因突变,2株nfxB突变。Higgins等［22］的研究显示,GyrA的Thr-83→Ile突变与环丙沙星的低度、高度耐药均有关;ParC的Ser-80→Leu突变仅出现在Thr-83→Ile突变基础上,和高度耐药有关;而mexR、nfxB基因突变仅出现在gyrA或parC突变的基础上而导致高度耐药。因此,铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类耐药主要是由于gyrA基因突变,parC、mexR和nfxB基因突变为次要因素。2.3低渗透性作用2.3.1外膜渗透性减低铜绿假单胞菌外膜渗透性降低原因主要是与外膜上孔道蛋白的结构与状态有关,其次也与孔道蛋白的数量减少有关。氟喹诺酮类药物是依靠铜绿假单胞菌的外膜蛋白和脂多糖的作用而进入细菌体内,外膜蛋白和脂多糖的变异均能使细菌摄取药物的量减少而导致耐药。已发现的外膜突变株有OmpC、OmpD2、OmpG、OmpF等的变异,均可导致耐药性。2.3.2生物膜形成生物膜是指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面,分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，将自身包饶其中形成的膜样物,其主要成分是藻酸盐。生物膜是细菌为适应环境而采取的一种生存策略,可以保护细菌逃逸宿主免疫和抗菌药物的杀伤作用。铜绿假单胞菌生物膜的耐药机制较为复杂:(1)胞外多糖被能阻止和妨碍抗生素渗入生物膜底层细胞。(2)胞外多糖被含有较高浓度的抗生素降解酶。(3)位于多糖被膜深部的菌细胞很难获得充足的养分和氧气,代谢废物也不能及时清除,因此这些细菌代谢低,甚至处于休眠状态,对各种刺激不再敏感。(4)因抗生素无法杀灭底层菌细胞,使其有足够的时间开启抗生素耐药基因等。随着抗生素的广泛应用,其耐药性问题也日益严重,成为困扰临床医师的一大难题。结语铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制极其复杂，它对喹诺酮类药物的耐药往往不是由单一因素造成的，而是由几种机制协同作用的结果。因此，综合评价铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制，分析其耐药机制和特点，可以指导临床合理用药和开发新的喹诺酮类药物提供帮助。当然,目前有关铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制仍存在许多问题还有待进一步探索,比如:(1)各种外排泵系统之间的相互关系如何。(2)外排泵调控基因突变与QRDR的突变分别在细菌耐药中的地位和相互关系如何。(3)铜绿假单胞菌的耐药性如此之高,其遗传学背景有何特殊之处等等。相信不久的将来,人们会逐渐解开这些谜。参考文献[1]WolfonJS,HooperDC.Fluroquinoloneantimicrobialagents[J].ClinMicrobiolRev,1998,2(3):378.[2]WangJC.DNAtopoisomerase[J].AnnRevBiochem,1996,6(5):635.[3]穆雪,陈升汶,王沙燕,等.铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制的研究进展[J].中华医院感染学杂志,2004,14（11）:1316.[4]KukeishiA,DiverJM,BecktholdB,etal.CloningandnucleotidesequenceofP.aeruginosagyrAgenefromPA01andquinolone-resistantclinical[J].AntimicrobChemother,1997,38(9):1944-1952.[5]YonezawaM,TakahataM,MatsubaraN,etal.DNAgyrasegyrAmutationsinquinoloneresistantclinicalisolateso