液相色谱质谱联用

液相色谱-----质谱连用的结构及样品的预处理技术1.液相色谱-质谱联用背景气相色谱-质谱联用在我国已有20多年的历史，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量和不挥发化合物分析，迫切需要用液相色谱质谱联用解决实际问题。液相色谱（HPLC)可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC/MS联用是分析界所期待。由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式MS鉴定，或制成衍生物用GC／MS分析。经过努力相继出现了多种液相色谱／质谱联用接口，实现了液相色谱／质谱的联用。特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为LC／MS的兼容创造了机会，商品化的小型LC／MS作为成熟的常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实验室发挥着重要作用。2.液相色谱-质谱联用适用范围液相色谱／质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。液相色谱质谱联用主要可以解决以下的问题：不挥发性化合物的测定；极性化合物的分析测定；热不稳定性化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析图谱。液相色谱-质谱联用基本流程3.液相色谱-质谱联用结构分析⑴离子源：使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子（离子）的装置，并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式不同，有机质谱中常用的有：EI，ESIEI:电子轰击电离——硬电离ESI:电喷雾电离——属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析大分子小分子APCI:大气压化学电离，更加适用于非极性分子的电离实验室中现有的离子源：EI,APCI电喷雾电离接口的结构和工作原理配套的电喷雾电离接口主要由两个功能部分组成：接口本身以及由气体加热，真空度指示，附加机械泵开关组成的控制单元。较新的设计中，接口操作包含在系统的整体控制之内。接口示意图如图所示的接口主要由大气压离子化室和离子聚焦透镜组件构成。喷口一般由双层同心管组成，外层通入氮气作为喷雾气体，内层输送流动相及样品溶液。某些接口还增加了“套气”设计，其主要作用为改善喷雾条件以提高离子化效率。离子化室和聚焦单元之间由一根内径为0.5mm的带惰性金属包头的玻璃毛细管相通，它的主要作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差，造成聚焦单元对离子化室的负压，传输由离子化室形成的离子进入聚焦单元并隔离加在毛细管入口处的3-8kv的高压，此高压的极性可通过化学工作站方便的切换以造成不同的离子化模式，适应不同的需要。离子聚焦部分一般由两个锥形分离器和静电透镜组成，并可以施加不同的调谐电压。较新的接口设计采用六级杆或八级杆作为离子导向器或离子聚焦手段，取代或部分取代了原先的锥形分离器和静电透镜组件。六级杆或八级杆被供给大约5MHz的射频电压以有效地提高离子传输效率（90%),灵敏度有很大提高。离子化过程：以一定流速进入喷口的样品溶液及液相色谱流动相，经喷雾作用被分散成直径约为1-3um的细小液滴。在喷口和毛细管入口之间设置的几千伏的高压下，这些液滴由于表面电荷的不均匀分布和静电引力而被破碎成更细小的液滴。在加热的干燥氮气作用下，液滴中的溶剂被快速蒸发，直至表面电荷增大到库伦排斥力大于表面张力而爆裂，产生带电的子液滴，子液滴中的溶剂继续蒸发引起再次爆裂。此过程循环往复直至液滴表面形成很强的电场，而将离子由液滴表面排入气相中，离子化过程完成。APCI接口的结构及工作原理APCI接口构成与ESI接口的区别⑴增加了一根电晕放针，并将其对共地点的电压设置为+-（1200~2000）V，其功能为发射自由电子并启动后续的离子化过程⑵对喷雾气体加热，同时也加大了对干燥气体的可加热范围。由于对喷雾U气体的加热以及APCI的离子化过程对流动相的组成依赖较小，故APCI操作中可采用组成较为简单的，含水较多的流动相。工作原理：放电针所产生的自由电子首先轰击空气中氧气、氮气、水产生O2+N2+NO+H2+O等初级离子，再由这些离子与样品分子进行质子或电子交换而使其离子化并进入气相。电喷雾（ESI）的特点通常小分子得到[M+H]+]+,[M+Na]+或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。大气压化学电离（APCI）特点大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。⑵质量分析器是：质谱仪中将离子按照荷质比分开的部分，离子通过分析器后，按不同荷质比(M/Z)分开，将相同的M/Z离子聚焦在一起，组成质谱。⑶检测接收器：接收离子束流的装置，有电子倍增器、光电倍增器、微通道板⑷数据及供电系统：将接收来的信号放大、处理并分析给出结果及控制质谱仪每个部分工作3.液相色谱-质谱分析条件选择优化（一）接口的选择：EI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。（二）正负离子模式的选择选择的一般原则：正离子模式:适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氮或叔氮时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氮水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。（三）流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸胺、乙酸铵等。还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节PH。LC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须1mmol/l(盐分太高会抑制离子源信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2%，含三氟乙酸≤0.5%，含三乙胺1%，含醋酸铵10-5mmol/l送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。（四）流量和色谱柱的选择不加热的ESI的最佳流速是1-50ul/min,应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多数采用1-1.2mm内径的微柱。APCID的最佳流速1ml/min，常规直径4.6mm柱最为合适。为了提高分析效率，常采用100mm的短柱，这对于大批量定量分析可以节约大量的时间。（五）辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂的效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。样品的预处理为什么要进行样品的预处理：从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。要求获得最佳的分析结果，从ESI电离的过程分析：ESI电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。样品制备要求：⑴样品要力求干净，不含显著量的杂质，尤其是与分析无关的蛋白质和肽类⑵不含有高浓度的难挥发酸(磷酸、硫酸等）及其盐，难挥发性酸及其盐的侵入会引起很强的噪声，严重时会造成仪器喷口处放电。⑶样品粘度不能过大，防止堵塞柱子、喷口及毛细管入口。样品的预处理常用方法a）超滤b）溶剂萃取／去盐c）固相萃取d）灌注（Perfusion）净化／去盐e）色谱分离反相色谱分离亲和技术分离f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化1.固相萃取固相萃取材料与柱色谱中所用类似，要根据被分析物和样品基质的性质，对于一般的有机物、带有烷基的疏水化合物和非极性化合物可用C18、C8、C2的非极性填料；对于亲水化合物、胺类和含羟基化合物可用氰基和二醇等键合的极性填料。对离子化合物可用离子交换树脂为填料。非极性填料的洗脱可用甲醇、乙腈、水或它们的混合液等，也可与PH缓冲液配合使用，对柱子进行预冲洗，达到有效去除杂质的目的。2.超滤在用于含有大量蛋白质的血浆或诸如牛奶中的小分子药物的分离时，要选用分子量截止范围为：1000~3000u的超滤管。其程序一般是先以1:1的水和乙腈混合液稀释等体积的样品并做振荡或漩涡混合，以减少样品中组分相互作用。将样品转移到超滤管中以3000~4000r/min的速度离心15~30min。管子底部的滤过液可直接用于分析。