食用菌栽培技术基础性实验

植物生产国家级实验教学示范中心《食用菌栽培技术基础性实验》实验项目序号实验项目名称建议学时数每组人数必选/可选1食用菌形态结构的观察22必选2母种培养基的配制23必选3高压蒸汽灭菌24必选4母种的转管及分离技术21必选5主要病虫害的识别23必选实验一、食用菌形态结构的观察常见与栽培的食用菌主要是担子菌亚门层菌纲和腹纲的一些种类，它们由双核菌丝分化形成子实体，子实体是有性孢子着生的器官其孢子外生在担子上，并聚集成一层子实层，但它们的子实体（担子实）形状因种类不同而有很大差别，故为我们认识食用菌类别的主要标志之一。一、目的要求使学生能找出食用菌次生菌丝的特征，分辨伞菌的微观构造；熟练制作标本片，能在显微镜下快速找出目标；并能分析图像不清的原因或排除显微镜的某些故障。二、仪器用品及实验材料1.器具：光学显微镜、尖头镊子、解剖刀、解剖针、解剖剪、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、火柴、蕃红染色剂、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。2.材料：平菇、草菇、香菇、蘑菇、金针菇等食用菌的斜面菌种与平板菌落，及其各种鲜子实体，胡萝卜。三、实验内容与方法（一）实验内容1.次生菌丝体的观察（菌苔形态及微观形态的观察）2.子实体的观察（外观形态及菌褶微观构造的观察）（二）方法步骤1、次生菌丝体的观察（1）肉眼观察从颜色、菌丝生长势、爬壁力、有无无性孢子、菌苔边缘特征等方面进行识别。（2）显微镜观察制片：在载玻片中央滴蕃红，用无菌接种针拨去气生菌丝，取其下绿豆粒大一薄片培养基置于蕃红染液中。放盖片，颠吸水纸后用手指适当按压，将培养基压碎，使其均匀平展于载玻片上。镜检：将标本片固定于载物台上，低倍镜下找理想目标，高倍镜下观察菌丝的分支、分隔、锁状联合等特征。2.子实体的观察（1）肉眼观察先观察完整子实体，从颜色、大小、及其菌盖、菌褶、菌柄、菌环、菌托等特征将各菌类的子实体进行比较识别。用解剖刀纵切子实体，观察菌盖和菌柄等部分的组成。从菌肉颜色、质地、菌褶着生情况；菌柄的质地、粗细、是否中实等方面进行比较。（2）微观观察切片：用尖头镊子取一小块菌褶，将其夹于胡萝卜条的切线中间，用刀片横切，切下的切片放入有蒸馏水的培养皿中，切片要求薄而均匀。制片：载玻片中央滴蒸馏水，用解剖针挑取最薄的切片放于载片水滴中，放盖片。镜检：将标本片固定于载物台上，用低倍镜找理想目标，再用高倍镜观察子实层、担子和担孢子的形态、大小及排列状况。四、思考题与实验报告1.表格总结平菇、蘑菇、草菇、金针菇、香菇等子实体各部分的宏观特征2.出次生菌丝、担子、担孢子及子实层的图像实验二、母种培养基的配制母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。一、目的要求掌握固化培养基的配制，学会棉塞的制作方法。分析有天然原料与无天然原料培养基在配制过程中的不同。二、仪器用品及实验材料1.器具：天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、漏斗架、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、棉花、线绳、牛皮纸、皮筋、纱布、电炉、菜刀、菜板、小铝锅等。2．材料：马铃薯、葡萄糖或蔗糖、麸皮、琼脂、水。三、实验内容与方法（一）实验内容1.制马铃薯滤液2.融化琼脂3.培养基的分装4．棉塞的制作（二）方法步骤1．配方（PDA）马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，自来水1000ml，pH自然。2．制作方法（1）制滤液马铃薯刮去粗皮，去芽眼，切成碎块，称量后放锅中，加水1200~1300ml，将其煮沸20min。用双层纱布过滤，取1000ml滤液。（2）化琼脂将滤液加热至即将沸腾时加入琼脂，不断搅拌（控制火力不要使培养基溢出或烧焦）。琼脂完全融化后加入剩余原料，并使其溶解（用热水补足水量）。（3）分装通过漏斗装置，趁热将培养基分装于试管中，装量约占试管高度的1/4（分装三角瓶，其装量以不超过其容积的一半为宜）。管口或瓶口不要沾染培养基。（4）制棉塞棉花以白色长绒的不脱脂棉花为宜。根据试管口大小取棉花，将其卷成棉塞，最好外包一层纱布。将棉塞塞入试管口。棉塞长度约6~7cm，塞入试管2/3。要求外表光滑，外包的纱布无皱折，松紧适宜等。A.正确;B.不正确（5）包扎管口堵入棉塞后7或9支试管扎一捆，棉塞部分用牛皮纸包扎。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。四、思考题与实验报告1.制取母种培养基时，配方中的天然原料应怎样处理？2.何时加入琼脂？融化时注意什么问题？3.分装的技术要求有哪些？4.棉塞的作用和技术要求有哪些？5.菌种培养时管口堵胶塞或软木塞行吗？为什么？实验三、高压蒸汽灭菌高压蒸汽消毒和常压蒸汽消毒统称湿热灭菌。通过饱和蒸汽杀死物体上和介质中的全部病原微生物及其孢子和芽孢。湿热灭菌的饱和蒸汽具有很强的穿透力，可以破坏病原微生物及其孢子和芽孢的核酸、使蛋白质变性凝固、酶失去活性。一、目的要求了解高压锅的构造及其功能，能独立完成各环节的操作。并能解释安全阀自动打开或灭菌不彻底的原因。二、仪器用品及实验材料1.材料培养基2.器具高压锅，1cm粗的木棍三、实验内容与方法（一）实验内容1.高压锅的构造2.高压锅的使用3.斜面培养基的摆制4.灭菌效果的检验（二）方法步骤1.高压锅的构造2.高压锅的使用3.斜面与平板培养基的制作将试管培养基趁热斜置于木棍条上，倾斜度以培养基约占管长的1/2为宜，不要使其滚动。若温度低可盖毛巾，以免形成过多的冷凝水。趁热将三角瓶中的培养基以无菌操作法注入无菌培养皿中，每皿的装量15~20ml（刚覆盖皿底）。4.灭菌效果的检验将凝固的斜面培养基放入37℃温箱培养2~3天，若光滑无杂菌生长，即可待用。四、思考题与实验报告1.图解说明培养基的配制过程，并指明要点。2.排除冷空气的时机、目的及方法是什么？3.保压的时机与方法是什么？4.灭菌时间从何时算起？5.摆制斜面的时机与方法是什么？6.导致灭菌后的培养基长有杂菌的原因有哪些？该怎样处理？7.灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?实验四、母种的转管及分离技术将母种移入新斜面培养基上的过程，称为转管。是一项重要的常规操作，常用的工具是接种环。无论引进或自己分离的母种，都需要适当传代，使之产生大量再生母种，才能源源不断供应生产。将子实体、菌核、菌索等一小块组织放于斜面培养基上，使其萌发为纯菌丝的方法，称为组织分离。该法具有简便、易成功、能保持原菌种性状等优点，但重复多易退化，应与孢子分离交替进行。组织分离法适用于绝大多数食用菌（胶质的耳类食用菌除外）。一、目的要求清楚无菌操作要点，熟练操作母种转管、多孢分离及组织分离技术。能正确分析自己的接种结果。二、仪器用品及实验材料1.材料空白斜面培养基、平菇母种、平菇子实体等2.器具酒精灯、接种环、火柴、尖头镊、酒精棉球、大镊子、接种箱、超净工作台、高锰酸钾、37％甲醛溶液、紫外灯、2%来苏水、标签纸等。三、实验内容与方法（一）实验内容1.接种环境的处理2.母种的转管3.组织分离4.多孢分离（二）方法步骤1.接种环境的处理（1）接种箱的熏蒸先用2%来苏清洁接种箱内外，放入接种所需的物品，用甲醛熏蒸。每立方米空间一般用甲醛10ml，加半量高锰酸钾（5~7g）使甲醛氧化挥发。先将高锰酸钾放入接种箱内的容器中，再注入甲醛，立即产生强烈刺激的甲醛气体。熏蒸时间至少保持30min以上。（2）超净工作台的消毒用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品，开启超净工作台上的紫外灯，照射20min后使用。2.母种的转管（1）手及菌种管的消毒用肥皂洗手，再用75％酒精棉球擦手和菌种管表面，在酒精灯焰上略烧试管外的棉塞后，立即将菌种管放入接种箱内。（2）转管两手从接种孔伸人接种箱内，酒精棉球擦拭接种环。左手持菌种管和斜面管，两支试管口对齐于火焰上方。右手持接种环，并将其在灯焰上干热灭菌，用小指及无名指拔掉棉塞，使棉塞底部朝外。接种环冷却后伸入菌种管内取略豆粒大带有培养基的菌种块，迅速移人斜面培养基的中部，菌丝朝上。然后，将棉塞在火焰上烧一下，立即塞入试管口，旋紧棉塞。接种环不要触碰管口及管壁。接种后的试管应立即贴标签，注明菌种名称及接种日期，再进行适温培养。3.组织分离法此法是生产中最常用的方法，具有操作简便，菌丝萌发快，分离所得的菌种在培养基条件适宜的情况下，能保持原菌种的优良性状。（1）种菇消毒在接种箱内，用镊子夹着燃烧的酒精棉球迅速擦拭菇体。（2）取接组织将菇体撕开，用无菌尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒大组织，放入斜面培养基上。迅速塞上棉塞。4.多孢子分离（1）钩悬法是一种特别适用于耳类，也适用于伞菌类的多孢分离法。在接种箱内将一小块消毒的耳片或菇片悬挂于无菌三角瓶内（装约1cm厚的培养基），在25℃左右条件下，约24h现孢子粉时以无菌操作法取出分离材料。适温培养后挑取健壮尖端菌丝转管。（2）孢子印分离法取成熟子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20～24℃静置一天，大量孢子落下形成孢子印，接种环沾少量孢子在试管培养基上划线培养。5.母种的培养将斜面朝下斜置叠放于瓷盘中，放于培养箱中适温培养。2～3天后每天都要检查菌丝生长情况。及时挑拣污染试管（出现粘膜或杂色）。6.注意事项（1）纯化菌丝长至斜面1/2时，挑尖丝转管，培养成再生母种。（2）出菇试验将再生母种扩成原种、栽培种，使其出菇。看产量、质量、形态、长势、抗性如何，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。（3）控制菌龄菌丝即将长满斜面（一般7～10天）终止培养。分别用于菌种保藏或繁衍原种。四、思考题与实验报告1.评比接种结果。2.分析自己接种成败的原因。3.孢子分离的母种为何一定要做出菇试验？4..试设计一个分离野生平菇菌种的实验方案。实验五、食用菌主要病虫害的识别食用菌所需的生态条件与生活条件同样有利于病虫害的滋生。若不采取必要的预防措施，不重视生态环境的控制，杂菌与害虫就会大量发生，对生产造成极大损失。随着食用菌生产迅速发展，由于多品种的周年性生产，以及作坊式简陋的生产方式，缺乏配套性病虫防治措施，使病菌、害虫种类日趋增多，危害加重，病虫害已成为食用菌高产、稳产的重要限制因素。掌握病虫害发生规律，使用有效防治方法，是食用菌生产中的重要管理内容。一、目的要求正确识别病虫害的形态特征及侵染症状，分析产生的原因，能采取正确的防治方法。二、仪器用品及实验材料1.材料:被侵染的培养料和子实体2.器具:放大镜、显微镜、解剖镜、接种针、尖头镊、载玻片、盖玻片、吸水纸、酒精灯、火柴、无菌水、染色剂等。三、实验内容与方法（一）实验内容1.竞争性真菌侵染症状的识别2.真菌病害的识别3.主要虫害的识别（二）方法步骤1.竞争性真菌侵染症状的识别外观:用肉眼和放大镜观察根霉、毛霉、青霉、木霉、曲霉、链孢霉等竞争性杂菌的危害症状镜检:载玻片中央滴半滴无菌水或染色剂，无菌尖头镊取少许污染材料置于水或染液中，无菌接种针轻轻拨散，放盖片。低倍镜找理想目标，高倍镜下观察各霉菌的形态特征。2.真菌病害的识别外观用肉眼和放大镜观察褐腐、褐斑、软腐病的危害症状。镜检载玻片中央滴半滴无菌水或染色剂，无菌尖头镊取少许病部组织置于水或染液中，无菌接种针轻轻拨散，放盖片。低倍镜找理想目标，高倍镜下观察各霉菌的形态特征。3.主要虫害的识别外观用肉眼和放大镜观察菇蚊、菇蝇、螨虫、线虫等害虫的危害症状。镜检虫卵的观察：载玻片中央滴半滴无菌水或染色剂，无菌尖头镊取少许被害材料置于水或染液中，无菌接种针轻轻拨散，放盖片。低倍镜找理想目标，高倍镜下观察各虫卵的形态特征。虫体观察：将菇蚊、菇蝇、螨虫、线虫等虫体置于解剖镜下观察。四、思考题与实验报告1.比较出根霉、毛霉、青霉、木霉、曲霉、链孢霉等竞争性真菌在症状及个体形态方面的不同点。2.比较褐腐、褐斑、软腐等真菌病的症状及个体形态的不同点。3.菇蚊、菇蝇的成虫、幼虫及卵的形态特征有哪些异同点？