银杏叶部内生真菌多样性的研究

Mycosystema菌物学报15July2009,28(4):[e-mail]1672-6472CN11-5180Q2009InstituteofMicrobiology,CAS,allrightsreserved.*Correspondingauthor.E-mail:[e-mail]收稿日期:2008-09-19,接受日期:2009-01-19银杏叶部内生真菌多样性的研究杜少康陈双林*林岱吴鸣谦王梅霞南京师范大学生命科学学院南京210046摘要：为了解我国特有植物银杏的叶部组织中内生真菌菌群的多样性和演替变化，分别于春、夏、秋季从江苏和山东两省的五个主要银杏栽培地采集健康叶片进行了内生真菌的研究。结果表明：所分离出的1971株内生真菌可归于32属，以交链孢属Alternaria（18.01%）、叶点霉属Phyllosticta（14.66%）和丝核菌属Rhizoctonia（14.56%）为优势菌群。在内生真菌的类群及组成上存在着部位、地区以及季节的差异性，也呈现一定的规律性。多样性指数的计算反映出所获得的银杏叶部内生真菌菌群具有不同的丰富度及均匀度，同时有一定的相似性。关键词：分离率，分离频率，优势菌群，多样性指数，相似性系数DiversityofendophyticfungiinleavesofGinkgobilobaDUShao-KangCHENShuang-Lin*LINDaiWUMing-QianWANGMei-XiaCollegeofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing210046,ChinaAbstract:DiversityofendophyticfungiinleavesofGinkgobilobawasstudiedinordertounderstanddiversitystateandsuccessionchangeofendophyticfungalcommunitiesinthisendemicplant.HealthyleafsampleswerecollectedfromfivemainplantinglocationsofG.bilobainJiangsuandShandongprovincesseparatelyinspring,summerandautumn.Atotalof1971strainsofendophyticfungiwasisolated.Asaresultofmorphologicalidentification32generawereobtained,ofwhichAlternaria(amountingto18.01%ofthetotal),Phyllosticta(14.66%)andRhizoctonia(14.56%)weredominant.Thedistributionandcompositionofendophyticfungivariedwithplantorganscolonized,localitiesandseasons,buttheyassumedregularitytoacertainextent.Populationsofendophyticfungiindifferentpartsoftheleavesindicateddifferentabundanceanduniformitybutassumedsimilaritytoacertainextent.Keywords:isolationrate,isolationfrequency,dominantpopulation,diversityindex,similaritycoefficient从deBary在1866年指出植物中存在有内生微生物，特别是从上个世纪80年代至今，大量的植物内生真菌资源被发掘出来，从而也证实了内生真菌在植物体内是普遍存在的（郭良栋2001）。从不同植物中分离到的内生真菌数量不同，Fisheretal.（1993）从光叶大戟EucalyptusnitensMaiden上分离Vol.28No.4505到60多种内生真菌。但是仅凭种数多寡来评价某种植物的内生真菌多样性丰富与否虽然直观却不够科学、客观和准确。另一方面，已有的研究资料表明：由于协同进化的作用使得某些内生真菌具有宿主专一性，平均每种植物有4－5种专性内生真菌（Petrini1991），因此，选择特有植物根据分离率分析内生真菌的特定组成和演替变化、运用多样性指数来评价其内生真菌的丰富度将有助于植物内生真菌多样性研究的深入。银杏GinkgobilobaL.是单科单属单种的多年生落叶乔木，为我国特有树种。其内生真菌的研究主要是由国内一些研究者开展，且主要集中在生物活性菌株的研究上，如对与宿主银杏相似的黄酮类化合物产生菌的分离和鉴定（王梅霞等2004；韩晓丽等2008），对产香的银杏内生镰刀菌G1024菌株的生物学特性和挥发性成分的研究（蒋继宏等2004；鞠秀云等2006），对银杏内生真菌抑菌活性的研究（申屠旭萍等2006，2007）等。在银杏内生真菌的多样性研究上，周松林等（2006）采用随机引物扩增多态性技术分析了银杏内生刺盘孢的遗传多样性，甘金莲等（2007）探讨了银杏内生真菌生态分布的一些特征，樊有赋等（2007）则研究了银杏内生真菌的种群多样性。本研究在江苏和山东两省的主要银杏栽培基地分别于春、夏、秋三季定点随机采样，通过菌种分离和鉴定以及分离率和多样性指数计算，分析了银杏叶部组织中内生真菌的组成、多样性和分布特征。1材料与方法1.1材料分别于2007年春季（5月）、夏季（8月）及秋季（11月）在5个样点（表1）采集银杏叶样品。在每一采样地点，随机选取相隔一定距离的若干健康的银杏植株采样。样品标记后置于保鲜袋中，于4℃保存，在12h之内对样品进行内生真菌的分离。1.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然，临用时加250mg/L链霉素。1.3内生真菌的分离、纯化及保藏采用常规的真菌组织分离法（方中达1998）。叶片剪成0.5cm×0.5cm左右的组织小块，叶柄剪成1cm长的小段。每次分离均选取叶片组织块200个，叶柄组织块50个。表1银杏叶组织采样地点及其生境Table1SamplingsiteandhabitatoftheleavesofGinkgobiloba采样地点Samplingsite采样生境Habitat江苏南京Nanjing,Jiangsu公园Park江苏泰兴Taixing,Jiangsu种植园Plantation江苏启东Qidong,Jiangsu公园Park江苏邳州Pizhou,Jiangsu种植园Plantation山东郯城Tancheng,Shandong种植园Plantation1.4内生真菌的鉴定依照真菌的经典分类鉴定方法，从纯化后培养数日的菌落上挑取菌体制成切片，置于光学显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、产孢结构等的形态特征，鉴定到属。真菌分类鉴定的工具书主要为《真菌鉴定手册》（魏景超1979），半知菌的鉴定则主要依据Barnett&Hunter（1998）的系统，并根据Kirketal.（2001）追寻属的变动采用目前的属名和定义。1.5数据处理采用分离频率比较判断优势菌群。分离频率（isolationfrequency，IF）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离总的内生真菌菌株数的百分率。采用分离率衡量植物组织中内生真菌的丰富程度和每个组织块受多重侵染的发生频率。分离率（isolationrate，IR）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离样品组织块总数的百分率。采用Shannon-Wiener指数（H）和Simpson指数（D）分析内生真菌的群落生物多样性。H=-Σ(Pi)(lnPi)、D=1-Σ(Pi)2，式中：Pi为属于种i的个体在全部个体中的比例；采用Evenness指数（J）分析群落物种分布的均匀程度。J=H/lnS，式中：H为506MycosystemaShannon-Wiener指数、S为物种总数目；采用Sorenson（Cs）及Jaccard（CJ）相似性系数比较两地之间内生真菌种类组成的相似程度。CS=2j/(a+b)，CJ=j/(a+b-j)，式中：j为两个样地共有种数或属数；a和b分别为样地A和样地B的物种数或属数。2结果分析2.1内生真菌的组成从五个地点三个季节采集的银杏叶中共分离得到内生真菌1971株，鉴定后归于32属，少数因不产孢而未鉴定出种属的暂归为一类——无孢菌群（Sterilemycelia）。分离得到的内生真菌多属于半知菌（94.82%），少数属于子囊菌（2.38%）。在目的分类水平上以半知菌中的丛梗孢目Moniliales和球壳孢目Sphaeropsidales为优势菌群，分别占总菌株数的37.85%和31%；在科的分类水平上以球壳孢科、暗梗孢科、黑盘孢科为优势菌群，分别占总菌株数的30.84%、27.84%和10.75%；在属的水平上以交链孢属Alternaria、叶点霉属Phyllosticta、丝核菌属Rhizoctonia为优势类群，分别占总菌株数的18.01%、14.66%和14.56%（表2）。2.2内生真菌的差异分布2.2.1内生真菌在不同部位的分布：各采样地春季柄中内生真菌的分离率均高于叶片，而夏、秋两季时叶片中内生真菌的分离率则显著高于叶柄（图1）。但是，叶片和叶柄内生真菌的种群组成却基本一致，优势菌群均为交链孢属Alternaria、叶点霉属Phyllosticta和丝核菌属Rhizoctonia。2.2.2内生真菌的地理分布：在5个采样调查地区之间，银杏叶中内生真菌的菌群组成存在差异，在分离率上表现为南京启东邳州郯城泰兴的规律（图1）。除共有的优势菌群以外，银杏叶部内生真菌还具有其各自地区的优势菌群。其中，南京为盘长孢属Gloeosporium（3.55%），泰兴为匐柄霉属Stemphylium（1.07%），启东为刺盘孢属Colletotrichum（3.65%），邳州为闭果霉属Sclerotiopsis（1.17%），郯城为拟茎点霉属Phomopsis（3.75%）。此外，部分内生真菌也具有一定的地理分布特性，泰兴为拟青霉属Paecilomyces（0.05%）和单格孢属Ulocladium（0.10%），郯城为丝葚霉属Papulospora（0.15%），邳州为黑腐菌属Guignardia（0.15%），南京为小丛壳属Glomerella（0.10%）（表3）。2.2.3内生真菌在不同季节的分布：在春、夏、秋三个季节中，春季内生真菌的分离率为7.76%，显著低于夏季的19.76%和秋季的25.04%（图1）。在图1银杏叶片和叶柄内生真菌菌群分离率随季节的变化Fig.1TheseasonalchangeofisolationrateofendophyticfungiinbladeandpetioleofGinkgobiloba.Spr.,Spring;Sum.,Summer;Aut.,Autumn;NJ,Nanjing;TX,Taixing;QD,Qidong;PZ,Pizhou;TC,Tancheng.Vol.28No.4507表2银杏叶部内生真菌的类群组成Table2ThecompositionofendophyticfungiinleavesofGinkgobiloba纲目科属分离率（%）分离频率（%）ClassOrderFamilyGenusIsolationrate(%)Isolationfrequency(%)半知菌FungiImperfecti丛梗