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蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation,PurificationandIdentificationofProtein分子生物学圣经—分子克隆实验指南为什么要纯化蛋白质？•理论意义：深入研究某种蛋白质的功能以及作用机制，如信号通路中的蛋白质…•应用价值---蛋白质工程医药、工业、科研…作为药物靶点…蛋白质是生命功能的执行者蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性•首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能；•其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料；•最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品。本章概要•蛋白质纯化方法•蛋白质纯化原则•纯化步骤•蛋白质的鉴定一、蛋白纯化方法•蛋白质纯化的根据：不同的蛋白质，理化性质不同。•理化性质不同的原因：氨基酸的数目和序列不同。1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性•①分子大小•②分子形状•③带电特性•④溶解特性•⑤与配体特异性结合不同•⑥吸附性质•⑦变性和复性1.1分子大小•蛋白质分子大小主要取决于：蛋白质肽链的数目每条肽链的氨基酸残基数目。几百~百万Da•常用方法▫透析▫超滤▫凝胶过滤▫离心透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。凝胶过滤是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析。•超速离心离心（centrifugation）：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。超速离心法(ultracentrifugation)：~60万g，6万~8万r/min。可用来测定蛋白质分子量。•超速离心1.2分子形状•形状▫蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受到分子形状的影响。•方法▫梯度离心▫电泳1.3电荷•原理▫蛋白质的净电荷与蛋白质等电点pI以及环境pH值有关（pHpI，－）•方法▫电泳▫离子交换层析1.4溶解度•原理▫蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。▫通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。•方法：沉淀法▫盐析法（eg.硫酸铵）▫有机溶剂沉淀法（eg.丙酮）▫等电点沉淀法•蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析。•盐析原理：▫高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。•盐析法1.5配体特异性结合•原理▫生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。•方法▫将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。•分类▫免疫亲和层析▫生物亲和层析▫金属螯合亲和层析1.6吸附性质•原理蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、陶瓷、塑料等。•方法▫疏水层析1.7变性和复性•原理▫变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。▫复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。•方法▫如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白2.分离方法在实验操作上，分为：•沉淀法•离心法•电泳法•超滤法•相分配法•层析法*不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序，*而且所用的主要技术手段都基本相同。•Note二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤•总原则•以合理的效率、速度、收率和纯度，•将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，•同时仍保留其生物学活性和化学完整性。二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤•步骤▫选择实验材料，实验材料预处理▫蛋白质的提取▫蛋白质的粗分级▫蛋白质的细分级▫蛋白质的鉴定蛋白质纯化的前期准备•关于蛋白质我们已知什么？•最好的来源？•蛋白质纯度要求？活性要求？•纯化蛋白的量？•如何进行鉴定？•纯化时间长短？•最终花费？•纯化方案？1、选择实验材料及预处理•选择实验材料▫物种的选择▫组织的选择•实验材料预处理▫液体材料过滤离心▫固体材料洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液材料破碎：•材料破碎•机械剪碎•研磨•反复冻融法•超声破碎法•高压匀浆法•酶解法2、蛋白质的提取•①提取分离原则▫尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）▫选择合适的pH、选择合适的离子强度2、蛋白质的提取•②提取液成分的确定▫pH缓冲液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,柠檬酸-柠檬酸钠…▫离子：动物NaCl,植物KCl▫还原剂:DTT…▫蛋白酶抑制剂：EDTA,PMSF…▫金属离子螯合剂:EDTA,EGTA…去污剂:SDS,CHAPS,TritonX-100,Tween-20甘油•③温度0~4℃3、蛋白质的粗分级（粗提）•使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。•常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤…4、蛋白质的细分级•粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。•常用的实验技术：层析4.1.层析（chromatography）固定相：凝胶流动相：缓冲液原理：•凝胶介质PharmaciaBioGelAagaroseBioGelPacrylamideBio-RadSephadexglucose(dextrose)SepharoseagaroseSephacrylglucose+acrylamideSephacelcellulose•层析装置（Chromatographicequipment）蠕动泵层析柱检测器记录仪部分收集器①②③4.1.层析（chromatography）•分子筛层析（Gelfiltration）•离子交换层析（Ionexchange）•疏水作用层析（Hydrophobicinteraction）•亲和层析（Affinity）4.1.1分子筛层析（Gelfiltration）•原理▫也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。•凝胶介质▫葡聚糖（glucose）▫琼脂糖（agarose）▫聚丙烯酰胺（acrylamide）▫纤维素（cellulose）•分子筛层析GelfiltrationchromatographyHydrophilicNospontaneousbindingtoproteins.ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow-rate•亲水•对蛋白质亲和力低•物理化学性质稳定•流速稳定•分子筛层析Gelfiltrationchromatography•分子筛层析Gelfiltrationchromatography•分子筛层析Gelfiltrationchromatography4.1.2离子交换层析（Ionexchange）•原理▫在一定的pH条件下，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。▫利用蛋白质和带电凝胶之间作用力的差别，把蛋白质分开的层析方法。4.1.2离子交换层析（Ionexchange）•种类▫阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷▫阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷•介质▫惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖…▫带电基团：羧甲基—带负电；二乙基氨基—带正电▫平衡离子：负电基团：H+或Na+正电基团：OH-或Cl-•离子交换层析（Ionexchange）阳离子交换：阴离子先，阳离子后阴离子交换：阳离子先，阴离子后4.1.3亲和层析（Affinitychromatography）•原理▫利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。▫将配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。•亲和层析（Affinitychromatography）•His-亲合示意图（金属螯合层析）固相载体镍柱（Ni-NTA）PETexpressionsystem4.1.4疏水作用层析•原理▫蛋白质表面疏水基团与介质疏水配体的可逆相互作用•方法▫高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。4.2.电泳（Electrophoresis）•电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。•蛋白质常用电泳技术•聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）•SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS--PAGE）•等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing-IEF）•双向电泳（TwoDimensionalElectrophoresis）4.2.1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳•SDS：•1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异•2、改变蛋白质分子构象，消除形状差异•电泳法测目标蛋白的分子量4.2.2不连续PAGE分离蛋白质的原理•在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。•原理▫电荷效应▫浓缩效应快慢离子效应凝胶浓度差效应▫分子筛效应4.2.3等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing—IEF）•等电聚焦（Isoelectricfocusing）4.2.4双向电泳•第一向：等电聚焦（pI）•第二向：SDS-PAGE(MW)•双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。①Isoelectricfocusing②SDSgelelectrophoresisTwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins-morethan2,000proteinswerevisualized蛋白质纯化策略方案设计篇Proteinpurificationstrategy三、纯化方案设计原则•确定纯化目标•purity,activityandquantity•充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性•tosimplifytechniqueselectionandoptimisation•确定活性测定方法•fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants•尽量减少纯化步骤•extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically•确定纯化目标三、纯化方案设计原则•确定目标•purity,activityandquantity•充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性•tosimplifytechniqueselectionandoptimisation•确定活性测定方法•fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants•尽量减少纯化步骤•extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically三、纯化方案设计原则•确定目标•purity,activityandquantity•充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性•tosimplifytechniqueselectionandoptimisation•确定活性测定方法•fastdete