第三章液相色谱-质谱联用技术

第三章液相色谱—质谱联用的原理及应用液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。液相色谱-质谱联用要解决的重要问题液相色谱流动相对质谱工作条件的影响质谱离子源温度对液相色谱分析源的影响一、LC-MS联用的接口技术常用于液相色谱质谱联用技术的接口主要有移动带技术（MB）、热喷雾接口、粒子束接口（PB）、快原子轰击（FAB）、电喷雾接口（ESI）等。其中，电喷雾接口的应用极为广泛。1.电喷雾（ESI）1）特点：具有高的离子化效率，对蛋白质而言接近100%；有多种离子化模式可供选择；对蛋白质而言，稳定的多电荷离子的产生，使蛋白质分子量测定范围可高达几十万甚至上百万；“软”离子化方式使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰。2）ESI接口的结构ESI源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统。电喷雾：现在常见的喷嘴是内径为0.1mm的金属毛细管。在它上面施加3～8kV的电压时。由于毛细管的顶端很窄，形成的电场强度可高达106V/m。当流速为0.5～5μL／min的LC流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。离子的形成：当表面带有大量电荷的精细液珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面积不断缩小，电荷密度增高。当此情况达到Rayleigh极限时，液珠会分裂成更小的液珠。在质量和电荷重新再分配后，更小的液珠进入稳定态；然后再重复蒸发、电荷过剩和液珠分裂。在整个过程的某个阶段，分析物可以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。离子的输送：大气压条件下形成的离子，在电位差的趋使下（当然也有压力差的作用）,通过取样孔（samplingcone）进入质谱真空区。离子流通过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一和第二降压区被抽走。电喷雾电离源ESINeedle喷雾针多层套管构成溶液雾化气（N2/Air）NebulizingGas干燥气DryingGas（N2）加快溶剂挥发电喷雾电离源ESITaylor锥库仑分裂Rayleigh稳定限形成正/负气相离子被吸入质量分析器电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（1～10µL∙min1）将气动辅助电喷雾技术运用在接口中，使得接口可与大流量（约1mL∙min1）的HPLC联机使用2.大气压化学电离源（APCI）大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning等人于20世纪70年代初发明的，20世纪80年代末得到突飞猛进的发展，与ESI源的发展基本上是同步的。但是APCI技术不同于传统的化学电离接口，它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术，样品溶液从LC流出被气化后，溶剂分子在电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子[M+H]+或[M-H]-，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。APCI是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定。另外，APCI还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3个数量级。大气压化学电离源APCINeedle喷雾针（加热）CoronaNeedle电晕针reagentgas试剂气离子-分子反应电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。样品流速：APCI源可从0.2到2mL／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1mL／min.断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子二、LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）。APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。2.正、负离子模式的选择：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。3.流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液。LC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/L。4.流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1-50mL/min，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用l-2.1mm内径的微柱，ESI源最高允许lmL/min，建议使用200-400mL/min；APCI的最佳流速～lmL/min，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱5.辅助气体流量和温度的选择操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。六大禁止禁止高浓度待测样品1ppm禁止用洗涤剂清洗玻璃容器禁止用塑料容器装有机溶剂禁止用不挥发性缓冲盐禁止高浓度有机缓冲盐10mM禁止无机样品进样建议采用等度洗脱采用甲醇作为流动相比例偏大采用小内径的色谱柱如2.1mm除MRM模式不能超过4个通道一个色谱峰的数据点在15-25个建议ESI广泛适用APCI效果更佳正模式广泛适用负模式本底更低，信噪比更高影响分子量测定的因素1）pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些，除对离子化有影响，还影响LC的峰形。2）气流和温度：水含量高及流量大时要相应增加。3）溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。4）溶剂和缓冲液的类型：通常正离子用甲醇好，负离子乙腈好些5）选择合适的液相色谱类型：正相、反相、选择合适的色谱柱6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时会使多电荷离子比例低，多聚体也减少7）样品结构和性质8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好9）样品浓度分子量测定中的误判溶剂中的杂质来自于塑料添加剂的峰样品容器不干净，常见表面活性剂的峰进样系统污染样品在源内碎裂，形成碎片离子分子量测定失败的原因a）流动相不合适b）不挥发性盐的影响c）成分复杂，杂质太多d)样品浓度不够e）pH值不合适f）样品在源内分解或碎裂目标化合物分析（1）选择离子监测（SIM）SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子。（2）母离子扫描母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。(3)中性丢失扫描中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失18Da的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。三、LC-MS的应用医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机化学：表面活性剂、染料LC-MS应用小分子化合物分析Mesocarb(双苯斯酮胺)ONNHNNHOONNHNNHONCOOHONNOHH3CH槟榔有效成分的分析槟榔含有多种人体所需的营养元素和有益物质，同时也含有多种药理活性成分，主要包括生物碱、酚类化合物、脂肪油以及多种氨基酸和各种各样的矿物质等。槟榔的主要作用是由槟榔碱的功效体现的。槟榔碱(Arecoline)属于生物碱，是一种含氮杂环的有机物，分子式C8H13O2N，沸点209℃，溶于醇、醚、氯仿和苯等有机溶剂，不溶于水。1．根据“氮规律”质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个N原子。2．结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比155的分子离子峰可以得到一个环加两个双键的数值。3．由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先消去一个中性分子甲基后得到最稳定的140质量数的最高峰。同时根据Beynon表及其最小碎片质量数42的所有可能性可以得到该化合物只能含有不超过两个N原子。（1个）4．对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。生物大分子分析多电荷离子指带有2个或更多电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。有机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子。它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。ESI在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常产生多重质子化的离子。下图是典型的ESI质谱图，由一簇不同程度质子化的分子离子峰组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两峰，由下列公式计算所含的质子数(n)和样品的分子量(M)。值m/z应的是所选所选择的两个峰x,x1n1nMxnnMx212113＋14+川牛膝HPLC—MS分析tR=17.67min的色谱峰，一级质谱数据(ESI，MS其为含量最大的峰，结合杯苋甾酮(分子量为520.3)是川牛膝的主要成分，推测该离子峰为杯苋甾酮分子加合一个甲酸根后形成的准分离子峰[M+HCOO]-。又其二级碎片图中有m/z=519.2，其应为杯苋甾酮分子失去一个质子形成的碎片离子峰[M-H]-。有m/z=501.4，这应是由于甾酮类物质中含有较多的羟基，其施加碰撞能后以水分子的形式失去而形成碎片离子峰[M-H-H2O]-。再结合其它的碎片离子与杯苋甾酮的结构相符，因此推断该化合物为杯苋甾酮。tR=16.22min的色谱峰，一级质谱