银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨

银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨杜爽杨磊仇雪梅摘要：为了筛选和检测牙鲆种群中具有较好表现的微卫星多态性,对聚丙烯酰胺凝胶及银染方法进行了选择。经过反复的实验，总结出了一套适用于牙鲆微卫星检测的方法。该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。关键词:银染;微卫星;聚丙烯酰胺凝胶微卫星DNA(microsatellite)又称简单序列重复(SampleSequenceRepeats,SSR)，一般以1～6个碱基为核心序列，经过多次的串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列[1]。与其它分子标记相比，微卫星标记具有的优点:微卫星标记具有座位数目巨大并随机分布于基因组中(内含子、外显子、基因间序列)、多态性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好和近缘种中引物通用性高等优点,在动物的群体遗传分析、亲子鉴定、基因组作图和遗传育种中得到了广泛的应用[2][3]。微卫星PCR产物的检测方法主要有荧光标记引物的测序法,同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法,以及银染变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法。目前很多国内外的实验室都是通过PAGE-银染的方法来鉴定微卫星产物。在鱼类微卫星PCR产物的鉴定中，变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法都有所报道[4][5]。本次实验，我们在应用微卫星标记对牙鲆群体的检测工作中,对银染聚丙烯胺凝胶电泳技术的最适条件进行了探索,经过多次实验,最终研究找到了其最适条件，可以对牙鲆微卫星DNA扩增产物进行更为准确、可靠的鉴定分析。1.材料和方法1.1材料1.1.1样本大连海域牙鲆群体30尾,取其肌肉加入70%乙醇后放入-20℃保存备用。1.1.2微卫星引物从NCBI上下载牙鲆微卫星序列，经过Primer5设计引物，由上海生物工程技术服务公司合成引物，并按照说明溶解引物。1.2方法1.2.1基因组DNA的提取采用文献[6]的酚、氯仿法抽提牙鲆的基因组DNA,得到的DNA加TE溶解后置-20℃冰箱中备用。1.2.2PCR反应PCR反应总体积为25ul，内含100ng的模板DNA，0.4umol/L的dNTPs，1.5mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，0.25ulTapDNA聚合酶（Promega）。反应在EppendorfMastercyclerPCR扩增仪上进行。PCR反应为30个循环，每个循环包括94℃变性35s，退火30s，72℃延伸40s；首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后72℃再延伸5min。1.2.3聚丙烯酰胺凝胶的配制1.2.3.1变性聚丙烯酰胺凝胶的配制表一不同浓度变性聚丙烯酰胺凝胶的配方药品与试剂浓度6%浓度4%尿素12.6(g)12.6(g)双蒸水14.5ml16ml10×TBE1.5ml1.5ml40%丙烯酰胺溶液(38:2)4.5ml3ml10%过硫酸胺溶液200μl200μlTEMED15μl15μl总体积30ml30ml1.2.3.2非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制表二不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方药品与试剂浓度8%浓度10%浓度12%30%丙烯酰胺溶液(29:1)8ml10ml12ml5×TBE6ml6ml6ml双蒸水16ml14ml12ml10%过硫酸胺溶液200μl200μl200μlTEMED15μl15μl15μl总体积30ml30ml30ml1.2.4银染液的配制固定液:10%的乙醇溶液染色液:0.1%AgNO3溶液和0.2%AgNO3溶液,对比效果显色液:为对比效果,采用两种显色液配方第一种配方:2gNaOH,0.1gNa2CO3,加双蒸水到250ml,在加入800μl甲醛[7]第二种配方:30gNa2CO3、1.5mL37%甲醛、0.2mLNa2S2O3(10mg/mL),加双蒸水至1000mL[8]1.2.5银染法的操作步骤固定10min→水洗2次(每次30秒)→染色15min→水洗3次(每次不超过30s)→显色(条带清晰即可)→终止。2.结果2.1非变性胶与变性PAGE胶的对比在凝胶电泳鉴定微卫星产物的过程中,变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶法都有使用。虽然两种PAGE胶检测基因型结果完全一致,但有实验表明，两种PAGE胶在条带分离效果上略有区别[9]。本次实验对这两种PAGE胶做了选择比较，结果如图一、二图一10%非变性PAGE胶图二6%变性PAGE胶从图中可以看出，非变性PAGE胶和变性PAGE胶都能清楚的显示目标带，且基因型相同。但是非变性PAGE胶带型要比变性PAGE胶好，更清楚。而且变性PAGE胶制胶过程比非变性PAGE胶复杂，操作繁琐。2.2不同浓度的非变性PAGE胶的对比按照表二分别配制8%、10%、12%的非变性PAGE胶用相同的PCR扩增产物分别点到三板不同浓度的胶上,上样量为6ul(其中上样buffer5μl,PCR扩增产物1μl)，1×TBE，140V恒压电泳5个小时(如图三,四)。M1234非特异性带非特异性带目标带非特异性带非特异性带目标带M1234图三12%非变性PAGE胶图四8%非变性PAGE胶从图中可以看出浓度为12%的PAGE胶条带较8%的清楚，10%、12%的没有什么明显差别。但由于12%的浓度大，电泳时间长，所以选择浓度10%的聚丙烯酰胺胶。2.3银染方法的比较2.3.1染色液的选择将一板聚丙烯酰胺胶的点样孔左右两部分分别点上相同的PCR扩增产物，固定后将胶一分为二，分别放入0.1%和0.2%的AgNO3溶液中，染色15分钟，加入相同显色液后，观察其结果。结果显示，0.2%的AgNO3溶液反应灵敏，5分钟就会显现条带，但是背景较深，略带墨绿色；0.1%AgNO3溶液12分钟显带，虽然显色时间比0.2%的长，但背景较浅，呈现淡黄色。2.3.2显色液的选择将一板聚丙烯酰胺胶的点样孔左右两部分分别点上相同的PCR扩增产物，经过固定、染色后，将胶一分为二，分别放入两种不同的显色液中（显色液配方见1.2.4）。经过反复的实验发现，两种显色液都能显现清晰的条带，但第一种染色液灵敏度高，颜色略浅一些，而且所用试剂价格比较便宜。3．讨论3.1对非特异性条带的思考聚丙烯酰胺凝胶的分辨率高，理论上能分开长度相差0.1%的DNA分子，但实际操作中，受到很多因素的影响。在银染后的凝胶上除看到主带外,还常伴随着出现一些显色较浅的非特异性带,且不同的引物产生的非特异性带不同。关于其的机制,Murray[10]等认为是DNA链复制过程中的滑动错配造成的。非特异性带的产生与模板和引物质量、退火温度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶的量、循环次数等诸多因素有关。本人通过多方面的摸索,觉得减少循环次数，相对升高一些退火温度和减少TaqDNA聚合酶的量是最有效的办法。通过改变这些条件，取得了良好的效果,有时非特异性带不能完全消除,但是它不会影响等位基因的判定,因为在某特定的位点上,非特异性带的带型通常是固定的,并且银染后主带比非特异性带清晰、易读。3.2非变性胶与变性PAGE胶的选择曲鲁江等[9]在对鸡的研究中发现，变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶对微卫星产物进行电泳时，二者对同一微卫星PCR产物的电泳结果有较大的差别,在非变性凝胶中条带过于复杂,出现的非特异性条带极大的影响了分析带形的准确性,从而使实验结果的误差大大加大。但是在本研究中，对同一微卫星PCR产物进行了比较，并没有发现较大的差别，都存在非特异性条带。而且非变性PAGE胶显示条带的结果比变性PAGE胶的效果好。分析原因可能是研究对象不5，4，3，2，1，M12345同，所以在分析结果上有所区别。3.3染色方法的探讨聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可以用溴化乙锭（EB）染色。由于EB染色的灵敏度不够高，对微量DNA片段的分析不太适用。另外，EB是致癌物，给实验操作带来很多不必要的麻烦。因此，本次研究采用银染的方法。该法既经济、简便、快速、灵敏,又具有无污染、分辨率高、结果可永久保存等优点，是一种检测微量DNA的理想方法[11]。在实验中有时也会遇到条带不清楚、背景发黄，颜色过深等问题。这与AgNO3溶液的浓度，显色液的配制，清洗水的质量、染色时间的长短等有关。在实际进行实验时，要摸索条件，使其达到最佳状态。4．结论本人经过多次实验发现，采用10%的非变性聚丙烯酰胺胶，0.1%的AgNO3溶液染色15分钟,2gNaOH,0.1gNa2CO3,加双蒸水到250ml,在加入800μl甲醛作为显色液，这种方法对于牙鲆微卫星的分离最为有效。5．参考文献[1]BeckmannJS,SollerM.TowardaUnifiedapproachtogeneticmappingofevkaryotesbasedonsequencetaggedmicrosatellitesites[J].BioTechnology,1990,8:930-932.[2]Pang,Ritland,Carlson,etal.Japanesequailmicrosatellitelociamplifiedwithchicken-specificprimers[J].AnimalGenetics,1999,30:195-199.[3]O′ConnellM,WrightJM.MicrosatelliteDNAinfishes[J].ReviewsinFishBiologyandFisheries,1997-7:331-363.[4]朱彩艳,叶卫,夏军红,鲮微卫星引物的鉴定及其适用性检验，南方水产，2007，3（2），15-19[5]匡友谊,佟广香,尹家胜,呼玛河哲罗鱼遗传多样性的AFLP分析，中国水产科学，2007，14（4）：615-621[6]J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著1黄培堂等译.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,2002.467-470.[7]SANGUINETTICJ,DIASNETOE,SIMPSONAJ.RapidsilverstainingandrecoveryofPCRproductsseparatedonpolyacrylamidegels[J].Biotechniques,1994,17(5):914-921.[8]BASSAMBJ,CAETANO-ANOLLESG,GRESSHOFFPM.FastandsensitivesilverstainingofDNAinpolyacryamidgels[J].AnalBiochem,1991,196:80-83.[9]曲鲁江，李显耀,杜志强，微卫星PCR产物变性与非变性PAGE银染检测方法的比较，遗传，2004，26(4):522～524[10]MURRAYV,CHUTIMAM1ThedeterminationofthesequencespresentintheshadowbandsofadinucleotiderepeatPCR[J]1NucleicAcidsRes1,1993,21(10):2395-23981[11]胡卫华,李铁臣,孙惠兰.非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法临床应用探讨[J].实用医学杂志,2005,21(4):425-427.本文章已被《生物技术通讯》收录