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12休无休时，了无了时人肯当下休，便当下了。若要寻个歇处，则婚嫁虽完，事亦不少。僧道虽好，心亦不了。前人云：“如今休去便休去。若觅了时无了时。”见之卓矣。3Callaspade，aspade实事求是Afallinpitagaininwit吃一堑长一智Themanwhohasmadeuphismindtowinwillneversay“impossible”一个决心取胜的人从来都不会说“不可能”Fourshortwordssumupwhathasliftedmostsuccessfulindividualsabovethecrowed:alittlebitmore成功的秘诀就是四个简单的字：多一点点（凡事比别人多一点点，多一点努力多一点实践多一点疯狂，多一点点就能创造奇迹）4你是一个富翁如果早上醒来，你发现自己还能自由呼吸，你就比在这一周离开人世的100万人更有福气。如果你从未经历过战争的危险、被囚禁的孤寂、受折磨的痛苦和忍饥挨饿的难受、你已经好过世界上5亿人。如果你的冰箱里有食物，身上有足够的衣服，有屋栖身，你已经比世界上70%的人更富足。如果你银行户头有存款，钱包里有现金，你已经身居世界上最富有的80%的人之列。如果你的双亲仍然在世，并且没有分居或离婚，你已属于稀少的一群。如果你能读到这段文字，那么，你更是拥有双份的福气，你比20亿不能阅读的人更幸福。5王维《九月九日忆山东兄弟》独在异乡为异客，每逢佳节倍思亲。遥知兄弟登高处，遍插茱萸少一人。采桑子重阳-------毛泽东人生易老天难老，岁岁重阳，今又重阳，战地黄花分外香。一年一度秋风劲，不似春光，胜似春光，寥廓江天万里霜。过故人庄[孟浩然]故人具鸡黍，邀我至田家。绿树村边合，青山郭外斜。开轩面场圃，把酒话桑麻。待到重阳日，还来就菊花。6（immunodeficientanimal)T淋巴细胞缺陷裸小鼠、裸大鼠B淋巴细胞缺陷性连锁免疫缺陷NK细胞缺陷Beige小鼠联合免疫缺陷T、B缺陷SCIDTB、NK联合缺陷鼠获得性免疫缺陷小鼠、猴、等AIDS模型免疫缺陷动物先天免疫缺陷第七章免疫缺陷动物7一）裸小鼠(nudemice)BALB/c裸基因位于11号染色体，主要特征：无毛（Hairless）、裸体（Naked）和无胸腺（Athymus）。毛发发育异常，不能让T细胞正常分化，细胞免疫低下，B细胞功能正常繁殖：雄鼠精子尾部呈盘卷状，无活动力，由于纯合雌裸鼠受孕率低，会食仔因此繁殖：纯合雄鼠（nu/nu)X杂合雌鼠(+/nu)--正常鼠（繁殖）和裸鼠（实验用）8无胸腺导致T细胞发生发育障碍。虽然T细胞和B细胞的前身正常，但因缺乏胸腺，故不能生成正常成熟T细胞，缺乏免疫反应，因此裸鼠是一种免疫缺陷动物。胸腺位于胸骨柄后方，心脏腹面，呈乳白色脂肪状，分左右两叶。胸腺分泌生物活性的多肽类物质，总称为胸腺素，它可刺激淋巴组织产生淋巴细胞；使来自骨髓、脾脏和其它组织和淋巴原始细胞成熟为具有细胞免疫活性的T淋巴细胞，从而发挥免疫作用。93、裸鼠在生物医学研究中的应用（1）组织移植（人类肿瘤移植）研究结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌等移植成功，并可传代。我国：人体结肠癌、直肠癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、咽癌、骨巨噬细胞癌的移植均获得了成功。10（2）肿瘤药物治疗和肿瘤免疫研究移植发囊，视网膜母细胞瘤等人的Burkitt淋巴瘤的裸鼠移植后对环磷酰胺有较高的敏感性，也与临床结果相符。其它肿瘤如乳腺癌和结肠癌裸鼠移植，对前者阿霉素和苯丙氨酸氮芥（7mg/kg）均有一定的抑瘤效能，对后者甲基-CCNO和丝裂毒素也明显疗效。有人用胸腺嘧啶核苷等444～888mg/kg给肿瘤裸鼠连续灌注96～140小时，发现它能明显抑制人体黑色素瘤及畸胎瘤的生长，并导致肿瘤消退而对宿主无明显毒性，这些新结果已引起了临床重视。11（3）免疫和遗传研究先天性无胸腺裸鼠的遗传因素，免疫动物原缺陷指标以及剖检所见和组织学观察等特征，均与人类免疫缺陷性疾病中的原发性细胞免疫病相似。各品系裸鼠因遗传背景的不同，所表现的细胞免疫反应和实验室检查指标亦各不相同，这些裸鼠种群是研究人类各种免疫缺陷性疾病的发病机理和遗传规律的动物模型。我国所应用的自发性免疫缺陷小鼠，主要应用的是BALB/c为遗传背景的裸鼠，个别实验室也应用了NIH、ICR等非近交系裸鼠12（4）病毒、细菌、寄生虫感染机制的研究结果说明，乙脑病毒感染后所产生的免疫力，主要属于细胞免疫，如使T细胞缺陷的裸鼠体内产生与免疫功能正常小鼠同等水平的免疫力，必须加大40倍的免疫剂量，才能达到。也说明裸鼠体内还存在着残余的T淋巴细胞。由此推论，在现场人群中产生抗体水平较低者，其T细胞功能是否缺陷，应作为因素之一加以探讨。13（5）生物制品和药品的检定生物制品（疫苗、菌苗）的安全性的免疫原性是制品必不可少的内容之一。它涉及制品是否有潜在致癌性、感染因子以及它的毒力是否有返祖的可能性。特别是在应用动物组织培养疫苗或人类二倍体细胞株时，对检出这些细胞潜在的致癌性，某些制品引起的异常发应及其发生机理，对药物致癌性或抗癌药物的研究等诸方面，先天性胸腺机能缺陷的裸鼠是很好的动物模型和实验手段。14（6）微生物学上的研究以往麻风杆菌只在背上有九条纹的犰狳（Armadillo）身上才能生长，而这种产于南美等地的动物难于寻找，也不易饲养和操作。1975年Colston等将麻风杆菌接种于裸鼠足掌，发现麻风杆菌可大量繁殖，引起瘤型麻风。又如淋巴细胞性脉络膜脑膜炎（LCM）病毒经脑内接种于无本病毒隐性感染的正常小鼠，可引起脑膜炎，感染细胞被当作靶细胞而受到破坏，在脑、脊髓内发生了明显的细胞免疫反应，但在T细胞缺损的裸鼠所见却完全相反，未导致动物的死亡，仅出现持续病毒血症，体内不出现LCM抗体，也无任何免疫反应。15二）裸大鼠(nuderat)一、生物学特点1953年发现，裸大鼠(nuderat)无胸腺，缺T细胞，B细胞功能正常（血清更多）四肢有少量毛16三）性连锁免疫缺陷小鼠(X-linkedimmunodeficiencymouseXID)B细胞功能缺陷。位于x染色体上，IgM等抗体少，研究Bruton无丙种球蛋白缺乏症。将正常鼠骨髓移到xid鼠中，B细胞可得到恢复。四）Beige小鼠纯合小鼠被毛完整，NK细胞活性缺陷，可导致溶酶体功能缺陷，对化脓菌敏感。17五）严重联合免疫缺陷小鼠（severe-combinedimmuodeficientmiceSCID）外观正常，造成T细胞不能分化成功能淋巴细胞，无抗体反应.胸腺、脾、淋巴结重量不及正常的30%,组织学上淋巴细胞显著缺乏，T、B细胞功能阴性，对外来抗原无细胞免疫和抗体反应，但其巨噬细胞、红细胞、自然杀伤细胞等功能正常。18许多人类寄生虫不能感染其它小鼠，而SCID小鼠不但可被人类丝虫病所感染，而且所出现的病变也与人类相似，因此是研究人类寄生虫病的新动物模型SCID小鼠肿瘤移植存活率高达36.9％，一般裸鼠为16.8％．少数可恢复免疫功能，称为渗漏现象繁殖：纯合子兄妹交配19裸鼠在肿瘤模型中的应用：一组织块法：将标本在1小时内接种在腋下，背部皮下,3－6mm3左右。3-5周后就可达到1-3cm3如将人乳腺癌块接种于裸鼠右腋乳垫下二悬液移植法：组织块匀浆后，细胞液注射，浓度1×107/ml左右，一般注射0.2ml。缺点：不易定位，如在肾包膜下，会流走三培养细胞移植法：腋下移植更好计算公式：瘤体积V=0.5×肿瘤最长径X肿瘤最短径。45d后，处死裸鼠，进行解剖，取肿瘤组织称重瘤重抑制率=(1一实验组平均瘤重／阴性对照组平均瘤重)×100％抑瘤率r=[(V对照组一V实验组)／V对照组】×100％。20检测方面1、对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用2、免疫组化法检测Casepase-7和PTEN蛋白2122二肿瘤的不同移植途径1）皮下移植（2）腹腔注射：0.2ml细胞悬液注入腹腔,若注入皮下可形成实体瘤（3）肾包膜下移植（人卵巢癌细胞系双侧移植）（4）原位移植（orthotopic)：如肝癌、肺癌移植到肝、肺中乳腺癌细胞，用1ml注射器将肿瘤细胞接种于裸小鼠左侧第二乳头的脂肪垫，接种量每只为只0.2ml含有2X106个细胞；1个月后(肿瘤长、短径大于1mm)开始治疗。23举例结肠癌原位移植：0.1ml细胞悬液注入肠壁肺癌原位移植：１）支气管移植：0.03ml细胞悬液注入支气管２）瘤块直接植入：１mm3瘤块（５块左右）缝入肺肿瘤保存：细胞悬液保存－－－液氮保存２年甚至１０年2425三影响移植模型成功的因素一激素如乳腺癌细胞在雌鼠可生长，卵巢切除后不生长，但注射雌激素可生长．前列腺癌细胞可在雄鼠中生长二鼠年龄有关小鼠（３周龄）更容易生长三肿瘤自身特征结肠癌和恶性黑色素瘤最高，乳腺癌低，分化低的也高四渗漏现象（少数ＳＣＩＤ鼠会恢复免疫功能），通过射线照射解决26五移植部位：腋下好，肾包膜下高于皮下，脑内接种最高（IgM不能通过血脑屏障），皮下很少转移，腹腔易转移六健康高清洁的环境中的裸鼠更易成功2728第八章基因工程动物一）转基因动物通过基因工程对DNA进行体外操作，添加或删除一个特殊的DNA序列，然后导入早期胚胎细胞中，产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的性状可以遗传给后代。二）基因敲除动物三）克隆动物29转基因动物和基因敲除转基因动物(transgenicanimal)基因敲除(geneknockout)购买：维通利华公司有部分转基因动物模型。30血友病B的治疗31基因工程产生的问题：价格高?只能生产简单的小分子担保，不能生产有着复杂结构的大分子蛋白?环境污染？数量有限？32第一节转基因动物一、概述转基因动物（transgenicanimal):用人工方法将外源DNA导入或整合到动物基因组内，并能稳定传代的动物。1982年Brinster&Palmiter大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵33supermice34各种转基因生物353637383940二、基本原理外源基因构成顺式作用元件+结构基因+报告基因（融合基因）报告基因常为荧光素酶、β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白（GFP)41外源基因的引入显微注射注射入受精卵结合克隆生产转基因动物胚胎干细胞法逆转录病毒感染法精子载体法发育植入受体动物的子宫或输卵管转基因动物中外源基因的检测Southern杂交、Northern杂交、Western印迹42三、基本方法1.显微注射法优点:导入速度快、操作简单对DNA大小无限制缺点:实验设备昂贵简化流程目的DNA制备——基因工程准备假孕母鼠（养母）准备供体母鼠——提供受精卵显微注射入雄性原核植入养母子宫、输卵管外源基因整合及表达检测通过互交、回交等育种手段获得纯合子传代纯合子转基因鼠（若外源基因的整合发生在细胞分裂后则只能得到嵌合体小鼠）43注射量仅一微微升442结合克隆生产转基因动物45克隆胚胎发育阶段46去核过程注射过程47各种克隆动物4849503.胚胎干细胞法——ES细胞特点：ES具有全能性。简化流程获取ES细胞稳定传代防止分化转化ES细胞（引入新基因、诱导基因突变、基因组改造等）筛选后克隆注射入囊胚期的胚胎中植入养母子宫，筛选嵌合体子代通过回交、互交等育种手段获得纯合子后代稳定传代5152534.逆转录病毒感染法主要适合于家禽类，其受精卵在出生时已发展至桑椹胚期5.精子载体法将外源DNA吸附到精子中洗涤精子电穿孔法、脂质体转染法等优点：便宜机制未明：怀疑与CD4蛋白有关5455注射过程去核过程56四、转基因动物的可能应用基因产品的制备——生物制药使用乳球蛋白的启动子可以使外源基因在乳腺中特异表达异种器官移植——转基因猪（实验阶段）建立人类疾病动物模型等高脂血症（H